新型尿液標志物在紫癜性腎炎患兒中的水平變化

馬一飛，李玉峰，郭桂梅，朱亞菊，龔瑩靚，董 瑜

上海交通大學醫學院附屬新華醫院小兒腎臟內科，上海 200092

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是兒童常見的血管炎，是兒童繼發性腎臟疾病的常見原因之一。HSP 引起的紫癜性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是影響預后的主要因素，嚴重者可進展為終末期腎功能不全[1]。臨床上評估HSP 腎臟損害主要依賴于腎活檢，但由于腎活檢為有創操作，患者重復檢測的依從性較差。因此通過尿液標志物來評估HSPN 的嚴重程度具有重要意義。近年來的研究[2]表明，血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）活化在腎臟病進展過程中十分重要；尿血管緊張素原（urinary angiotensinogen，UAGT）可以反映腎臟局部RAS 活化程度。成纖維細胞特異蛋白-1（fibroblast-specific protein-1，FSP-1）是成纖維細胞的標志物，反映腎小管上皮細胞、間充質細胞的轉分化水平[3]，在HSPN 疾病發展中非常重要。尿凝血酶（thrombin）可反映新月體腎炎炎癥水平及腎臟局部凝血活動中的作用[4]。

本研究通過檢測新型尿液標志物UAGT、FSP-1 及尿凝血酶在尿檢正常兒童、HSP 患兒和HSPN 患兒中的水平，及在不同治療階段的HSPN 患兒中的水平，初步探討3 種新型尿液標志物在HSPN 診斷及療效評估中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象及其臨床資料

選取2016 年4 月—2019 年10 月上海交通大學醫學院附屬新華醫院小兒腎臟內科收治的HSPN 患兒（HSPN組，n=14）、尿檢正常的HSP 患兒（HSP 組，n=28）及尿檢正常的兒童（對照組，n=23）。HSPN 患兒的診斷標準參考中華醫學會兒科學分會腎臟病學組發布的《紫癜性腎炎的診治循證指南（2016）》；在排除合并心血管系統疾病、慢性肝腎疾病、其他風濕性疾病、泌尿系統感染等疾病的同時，均行腎穿刺活檢術明確腎臟病理改變，且腎小球病理分級均為Ⅲ級以上，即病理檢查提示系膜增生，伴有＜50%腎小球新月體形成和（或）節段性病變（硬化、粘連、血栓、壞死），其系膜增生又分為局灶/節段和彌漫性[5]。HSPN 組患兒均尚未經過治療。HSP 患兒的診斷根據歐洲抗風濕病聯盟和歐洲兒童腎臟病防治委員會標準[6]，表現為孤立性皮膚白細胞增生性血管炎，即具有典型過敏性紫癜皮疹，可合并關節或腹部癥狀，排除腎臟受累癥狀，如蛋白尿、血尿。另選取尿檢正常，排除過敏性紫癜及其他血管炎診斷的兒童作為對照組。

選取同一時期入院進行治療的HSPN 患兒，治療方案采取糖皮質激素（glucocorticoid，GC）聯合免疫抑制劑，具體方案為甲潑尼龍（methylprednisolone）沖擊治療[15 ～30 mg/ （kg·d），靜脈滴注，每日最大劑量不超過1.0 g，隔天給藥，3 次后間隔1 周為1 個療程，共2 個療程]，聯合環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）序貫沖擊治療[8 ～12 mg/ （kg·d），靜脈滴注，連續給藥2 d 后間隔2 周為1 個療程，共6 個療程]。根據不同的治療階段，將HSPN 患兒分為未治療組10 例、GC 組（GC 沖擊治療2 個療程結束）9 例、GC+CTX 組（GC 沖擊治療2個療程聯合CTX 序貫沖擊治療6 個療程結束）8 例，各組患兒之間無重復病例。收集以上患兒的性別、年齡、體質量等基本信息以及入院當天的血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白定量、新月體指數等指標。

患兒入院當天均留取新鮮晨尿5 mL，于4 ℃下1 308×g 離心15 min，收集上清液凍存于-80 ℃，用于UAGT、FSP-1、尿凝血酶的檢測（部分患兒未檢測尿凝血酶）。所有入組尿樣均獲得入選對象監護人的知情同意。

1.2 UAGT、FSP-1、尿凝血酶及尿肌酐檢測

尿肌酐（urinary creatinine，Ucr）采用全自動生化分析儀（7600，日本Hitachi）檢測。UAGT 檢測試劑盒購自日本IBL 公司（貨號27412），尿FSP-1 檢測試劑盒購自日本MBL 公司（貨號CY-8086），尿凝血酶檢測試劑盒購自中國武漢華美公司（貨號CSB-E14235h）。具體操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析，采用單個樣本K-S 檢驗正態分布。正態分布的定量資料采用±s 表示；若符合方差齊性，則組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法；若方差不齊，組間比較采用秩和檢驗。非正態分布的定量資料，采用M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗。定性資料用頻數（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

在不同疾病患兒一般資料的比較中，HSPN 組患兒14 例，年齡（10.00±2.04）歲；HSP 組患兒28 例，年齡（6.11±2.48）歲；對照組兒童23 例，年齡（5.17±3.10）歲。其中HSPN 組患兒的年齡大于其他2 組，血肌酐和體質量高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；但3 組間性別比、血尿素氮差異均無統計學意義 （表1）。

表1 HSPN 組、HSP 組患兒和對照組兒童一般資料的比較Tab 1 Comparison of the general information among HSPN group, HSP group and control group

在HSPN 不同治療階段患兒基線資料（治療前）的比較中，未治療組10 例，年齡（10.03±2.05）歲；GC組9 例，年齡（8.67±2.45）歲；GC+CTX 組8 例，年齡（8.88±2.59）歲。3 組患兒治療前基線資料的各項指標差異均無統計學意義（表2）。

表2 未治療組、GC 組和GC+CTX 組HSPN 患兒基線資料的比較Tab 2 Comparison of the general information among untreated group, GC group and GC+CTX group

2.2 HSP 累及腎臟時UAGT、FSP-1 和尿凝血酶水平的變化

分別檢測HSPN 組、HSP 組患兒和尿檢正常兒童的UAGT、FSP-1 和尿凝血酶水平。由于UAGT 經腎小球濾過，用Ucr 校正UAGT 水平。HSPN 組UAGT/Ucr 和FSP-1均顯著高于HSP 組和對照組（均P＜0.05），而HSP 組與對照組間差異無統計學意義。HSPN 組患兒尿凝血酶水平與HSP 組間差異無統計學意義，但2 組均顯著高于對照組（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 HSPN 組、HSP 組患兒和對照組兒童UAGT/Ucr（A）、FSP-1（B）和尿凝血酶（C）的表達Fig 1 Levels of UAGT/Ucr (A), FSP-1 (B) and thrombin (C) in HSPN group, HSP group and control group

2.3 HSPN 不同治療階段UAGT、FSP-1、尿凝血酶水平及24 h 尿蛋白定量的變化

圖2 未治療組、GC 組和GC+CTX 組HSPN 患兒UAGT/Ucr （A）、FSP-1 （B）、尿凝血酶（C）及24 h 尿蛋白定量（D）水平Fig 2 Levels of the UAGT/Ucr (A), FSP-1 (B), thrombin (C) and 24 h urine protein (D) in untreated group, GC group and GC+CTX group

在HSPN 患兒的不同治療階段，UAGT/Ucr、FSP-1、尿凝血酶和24 h 尿蛋白定量水平均在未治療組最高，GC組和GC+CTX 組均有一定程度的降低，但完成GC 序貫CTX 沖擊治療后僅UAGT/Ucr 和24 h 尿蛋白定量顯著低于未治療組（均P＜0.05），尿凝血酶在3 組間差異均無統計學意義。FSP-1 在GC 沖擊治療后即較未治療組顯著下降（P＜0.05），但序貫CTX 沖擊治療后反而出現了回升，與未治療組間差異無統計學意義（圖2）。

3 討論

HSP 患兒若發生腎臟損害會對其遠期預后有較大的影響，少部分HSPN 患兒可進展為終末期腎病。目前HSPN的嚴重度評估主要依賴于腎活檢，新月體指數越高，說明損傷程度越嚴重。及時動態評估腎臟損害程度有利于指導臨床開展精準治療。腎活檢有一定的創傷，臨床上重復腎活檢依從性差；如有無創、簡便、特異的尿液標志物幫助臨床醫師早期發現疾病進展并盡早干預，既可改善預后，又可避免過度治療。

近年來研究發現了多種與新月體形成相關的尿液標志物。腎臟局部RAS 在腎臟病理生理中起重要作用。腎臟內存在完整獨立的局部RAS[7]，其活化在包含IgA 腎病在內的腎病進程中至關重要。血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）主要通過血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）等的作用轉化為血管緊張素Ⅱ型（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）發揮作用，后者可通過與血管緊張素受體（angiotensin receptors，ATR）結合，導致腎小球內壓升高，腎血流量減少，繼而引起腎小球濾過率下降，并刺激腎小球系膜細胞增生、活化和肥大，促進細胞外基質增生[8-9]。另外Ang Ⅱ可以誘發、參與炎癥反應，并通過影響白細胞對血管內皮細胞的損傷作用，改變血管通透性，引起血管炎[10]，并通過激活氧化應激系統、誘導上皮 - 間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）介導新月體的形成。免疫組織化學實驗表明，UAGT 與腎臟內Ang Ⅱ染色強度呈正相關，與血AGT 水平無關，提示UAGT 可以較好地反映腎臟局部RAS 活性。在本研究中，UAGT/Ucr 在HSPN 組的水平顯著高于HSP 組和對照組，而后2 組間差異無統計學意義；表明HSPN 發病過程中存在局部RAS 活化，導致腎臟局部AGT 水平明顯升高。另HSPN 患兒經過GC 和CTX 序貫沖擊治療后，24 h 尿蛋白定量逐步減少，UAGT/Ucr 水平亦隨之下降，可見UAGT/Ucr 水平在評估病情進展和療效上具有一定的價值。

FSP-1 又稱S1004A 蛋白，是S100 蛋白家族成員之一，分布于人類的成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種細胞中，但正常腎臟細胞中未見表達。FSP-1 在EMT過程中起重要作用[11-12]。Iwano 等[13]發現FSP-1 在新月體腎炎患者的尿液中顯著升高，Turnier 等[14]在狼瘡性腎炎患者中亦發現FSP-1 與新月體指數及疾病活動度有關。故尿FSP-1 可反映腎臟新月體的形成程度。在本研究中，HSPN 組的FSP-1 水平較HSP 組和對照組明顯升高，表明HSPN 患兒腎臟損害過程中激活新月體形成，并出現EMT 及纖維化現象。在后續治療評估中，GC 沖擊可引起FSP-1 水平明顯下降，但在序貫CTX 沖擊后出現了小幅回升。由于HSPN 患兒在治療后期腎臟的纖維化程度未進行病理學檢查，無法從病理學角度加以驗證。

尿凝血酶與慢性腎臟病關系密切。早在2004 年，有研究[15]發現尿凝血酶與腎小球腎炎相關，反映腎小球腎炎局部凝血過程。2015 年，Kitamoto 等[4]發現尿凝血酶可反映新月體腎炎的活動程度；這可能與腎小球內纖維蛋白的沉積有關，后者可促進腎臟局部凝血酶生成，參與腎臟局部細胞外基質代謝調控，與細胞外基質的完整性密切相關，而細胞外基質系統的紊亂是新月體形成的重要因素。因此，尿凝血酶可反映腎臟新月體形成以及炎癥活化的程度。在本研究中，尿凝血酶在HSPN 組中水平顯著高于對照組，但與HSP 組差異不大，提示HSP 患兒無論是否累及腎臟，都可能引起尿凝血酶升高，推測可能與HSP 引起廣泛的血管炎，導致凝血功能異常有關。另外，尿凝血酶在GC 組及GC+CTX 組患兒中的水平較未治療組有所下降，但差異無統計學意義。一方面可能提示尿凝血酶與腎臟受損無明顯相關性，與血管炎關系更密切；另一方面可能與樣本量較少有關，需要收集更多的病例資料加以明確。

綜上所述，UAGT/Ucr 和尿FSP-1 可以在一定程度上反映HSP 患兒有無發生腎臟損害，并有可能對HSPN 患兒的療效有一定的提示作用。

參·考·文·獻

[1] Davin JC, Coppo R. Henoch-Sch?nlein purpura nephritis in children[J]. Nat Rev Nephrol, 2014, 10(10): 563-573.

[2] Urushihara M, Kagami S. Role of the intrarenal renin-angiotensin system in the progression of renal disease[J]. Pediatr Nephrol, 2017, 32(9): 1471-1479.

[3] Harada K, Akai Y, Yamaguchi Y, et al. Prediction of corticosteroid responsiveness based on fibroblast-specific protein 1 (FSP1) in patients with IgA nephropathy[J]. Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(10): 3152-3159.

[4] Kitamoto Y, Arizono K, Fukui H, et al. Urinary thrombin: a novel marker of glomerular inflammation for the diagnosis of crescentic glomerulonephritis (prospective observational study)[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0118704.

[5] 中華醫學會兒科學分會腎臟學組. 紫癜性腎炎診治循證指南(2016)[J]. 中華兒科雜志, 2017, 55(9): 647-651.

[6] Ozen S, Ruperto N, Dillon MJ, et al. EULAR/PReS endorsed consensus criteria for the classification of childhood vasculitides[J]. Ann Rheum Dis, 2006, 65(7): 936-941.

[7] 章曉燕, 呂文律, 滕杰, 等. 慢性腎臟病患者尿血管緊張素原與腎臟腎素血管緊張素系統活性的相關性[J]. 中華腎臟病雜志, 2011, 27(5): 327-332.

[8] Urushihara M, Nagai T, Kinoshita Y, et al. Changes in urinary angiotensinogen posttreatment in pediatric IgA nephropathy patients[J]. Pediatr Nephrol, 2015, 30(6): 975-982.

[9] Kobori H, Urushihara M. Augmented intrarenal and urinary angiotensinogen in hypertension and chronic kidney disease[J]. Pflugers Arch, 2013, 465(1): 3- 12.

[10] Yamamoto T, Nakagawa T, Suzuki H, et al. Urinary angiotensinogen as a marker of intrarenal angiotensin Ⅱ activity associated with deterioration of renal function in patients with chronic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(5): 1558-1565.

[11] Nishitani Y, Iwano M, Yamaguchi Y, et al. Fibroblast-specific protein 1 is a specific prognostic marker for renal survival in patients with IgAN[J]. Kidney Int, 2005, 68(3): 1078-1085.

[12] Mishra SK, Siddique HR, Saleem M. S100A4 calcium-binding protein is key player in tumor progression and metastasis: preclinical and clinical evidence[J]. Cancer Metastasis Rev, 2012, 31(1/2): 163-172.

[13] Iwano M, Yamaguchi Y, Iwamoto T, et al. Urinary FSP1 is a biomarker of crescentic GN[J]. J Am Soc Nephrol, 2012, 23(2): 209-214.

[14] Turnier JL, Fall N, Thornton S, et al. Urine S100 proteins as potential biomarkers of lupus nephritis activity[J]. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 242.

[15] Kitamoto Y, Tomita K, Imamura T. Assessment of thrombin in the urine of glomerulonephritic patients by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Ann Clin Biochem, 2004, 41(Pt 2): 133-137.