基于CD169 表達水平的小鼠脾紅髓巨噬細胞分型研究

楊施琪，李夢瑤，劉思明，劉智多

上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所，上海 200025

脾是人體最大的周圍淋巴樣器官，實質由紅髓、白髓及其邊界（稱為邊緣區）組成[1-2]，是重要的次級免疫器官。小鼠脾內的巨噬細胞主要分為位于紅髓的F4/80+CD11b-紅 髓 巨 噬 細 胞（red pulp macrophage，RpMΦ）、位于邊緣區的F4/80-/lowMARCO+邊緣區巨噬細胞（marginal zone macrophage，MZMΦ）、F4/80-CD169+嗜金屬巨噬細胞（marginal metallophilic macrophage，MMMΦ），以及白髓內的F4/80-CD68+著色小體巨噬細胞（tingible body macrophage，TBMΦ）[3-4]。因此，利用小鼠含生長因子樣模體黏液樣激素樣受體（mouse EGFlike module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，F4/80）和CD11b 可以很好地將RpMΦ 與其他脾巨噬細胞種群區別開。RpMΦ 分布在脾紅髓中，其壽命長，從卵黃囊巨噬細胞或胚胎造血干細胞發育而來，長期表達于成年組織中，在穩定狀態下骨髓來源的單核細胞對其產生的貢獻很小，被認為是組織駐留巨噬細胞[5-8]。

與其他組織駐留巨噬細胞相比，RpMΦ 具有獨特的 轉 錄 譜，Spic、Axl、F4/80、Cd68、Vcam1、Pecam1和Ccr3 等基因在RpMΦ 中高表達[9-12]。更重要的是，RpMΦ 對于機體十分關鍵，其主要功能包括：①吞噬流經紅髓的衰老或受損紅細胞[13-14]，回收血紅蛋白中的鐵[6]。②產生Ⅰ型干擾素對抗寄生蟲感染[15]。③通過分泌抑炎因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），誘導調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）產生，從而調控過度的免疫反應[16]。由于RpMΦ 擁有諸多功能，對其展開的研究可加深人們對于脾內血源性感染以及某些自身免疫病及免疫缺陷病的理解。因此，對于RpMΦ 的功能及分型值得進一步研究。

CD169 分子最初發現于巨噬細胞中[17]。然而，CD169的功能至今仍未被完全闡明。一方面，CD169 可直接或間接地識別病原體結構，將病原體從血液中移除并遞呈給其他免疫細胞[18]。另一方面，CD169 可與多種淋巴細胞進行唾液酸依賴性結合，介導細胞間的相互作用，調節免疫反應[19]。目前的研究[20]發現，CD169 除了在MMMΦ 上表達，也能夠在部分RpMΦ 上表達，但該現象尚未被明確解釋。因此，本研究利用流式細胞術和免疫熒光法2 種手段證實CD169 能夠在RpMΦ 上表達，并通過對CD169+和CD169-RpMΦ 亞群進行RNA 測序，研究這2 個亞群在基因表達水平之間的差異，從而探索不同亞群可能具有的免疫學功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象、試劑及儀器

1.1.1 實驗動物 8 ～12 周齡、雌性、近交系C57BL/6J小鼠購于上海靈暢實驗動物有限責任公司[生產許可證號為SCXK（滬）2018-0003，使用許可證號為SYXK（滬）2018-0027]；向C57BL/6J 小鼠敲入CD169 Dtr （diphtheria toxin receptor）獲得CD169 Dtr+/+小鼠[該純合子小鼠無法表達CD169，被用來作為CD169 敲除（CD169 KO）小鼠，C57BL/6J 背景］購自日本 Riken 實驗室（實驗動物倫理批件號為A-2017-003），飼養于上海交通大學醫學院實驗動物中心屏障環境內。實驗操作符合上海交通大學醫學院動物倫理相關規范。

1.1.2 主 要 試 劑 小 鼠CD11b-APC/Cy7 抗 體（M1/70，BioLegend，美國），小鼠F4/80-FITC（fluorescein isothiocyanate）抗 體（BM8，BioLegend， 美 國）， 小 鼠CD169-PE 抗體（SER-4，eBioscience，美國），Ⅳ型膠原酶（Sigma，美 國）， 脫 氧 核 糖 核 酸 酶Ⅰ（Dnase Ⅰ，Roche， 美國），甲醇（上海大合化學品有限公司），4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA，BBI 生命科學有限公司），蔗糖[生工生物工程（上海）股份有限公司]，Mouse FITC 陽性結合試劑盒（Stemcell，美國），總RNA 抽提試劑TRIzol（Thermo Scientific，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI 1640 無血清基本培養基（Gibco，美國），SYBR Green Master（Toyobo，日本）。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺、細胞培養箱（Thermo Scientific，美國），磁力架（Stemcell，美國），LSRFortessa 分析型流式細胞儀、FACSAria Ⅱ流式細胞儀（BD，美國），PCR 儀（Eppendorf，德國），實時熒光定量PCR儀（ABI，日本），SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡、Leica CM1950 冰凍切片機（Leica，德國），Illumina Hiseq X Ten測序儀（Illumina，美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠RpMΦ 的獲取及CD169 的檢測 將小鼠的脾剪碎，用含0.1% Ⅳ型膠原酶和0.005% Dnase Ⅰ的RPMI 1640 培養基于37 ℃培養箱進行培養。隨后，經45 min消化后，過70 μm 細胞濾網，于400×g 離心后棄上清液。加入5 mL 紅細胞裂解液，室溫靜置5 min，加入15 mL 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）終止裂紅。于400×g 離心棄上清液后，用 1 mL FACS buffer[1×PBS，2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和 5 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉]重懸，計數單細胞懸液。取1×106個細胞于每個染色組，加入F4/80、CD11b 及CD169 抗體，4 ℃孵育 30 min，FACS buffer 洗滌2 遍后，利用LSRFortessa 分析型流式細胞儀進行檢測。

1.2.2 CD169+RpMΦ 的免疫熒光檢測 頸椎脫臼法處死小鼠。取脾，先后放入1% PFA 和30%蔗糖溶液中固定及脫水，用OCT 包埋劑（optimal cutting temperature compound）包埋脾，-80 ℃保存。使用冰凍切片機制備脾薄片，切片厚度為20 μm。將帶有組織切片的載玻片用PBS 清洗并于-20 ℃甲醇中通透30 min，經PBS 清洗 3 遍后用封閉液（0.3% Triton X-100，1% BSA，1% FBS 和 0.1 mol/L Tris-HCl）室溫封閉1 h，加入F4/80 和CD169 抗體室溫染色3 h，PBS 清洗后封片，在避光處晾干。組織切片用Leica SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡在20 倍物鏡下進行拍攝，以LIF 格式保存，用Imaris 軟件進行圖像處理。

1.2.3 小鼠脾F4/80+細胞分選 由于F4/80+CD11b-RpMΦ 在脾細胞中占比約為1%，為收集到足夠數量的CD169+和CD169-亞群，本研究利用FITC+磁珠對紅髓巨噬細胞進行富集。獲得單細胞懸液后調整細胞濃度至2×108個/mL，加入Fc 封閉抗體于室溫封閉10 min 后，加入F4/80-FITC 于4 ℃避光染色30 min。每2×108個細胞加入11.6 μL 分選液，室溫孵育15 min，再加入6 μL磁珠室溫孵育10 min。將裝有細胞的圓底管置于磁力架上，通過磁力吸附收集獲得F4/80+細胞。加入CD11b-APC/cy7、CD169-PE 抗體于4 ℃避光孵育30 min，利用FACSAria Ⅱ流式細胞儀得到小鼠脾CD169+/CD169-紅髓巨噬細胞。

1.2.4 RNA 測序及數據處理 向CD169+/CD169-細胞中加入TRIzol 裂解液提取總RNA，每個亞型做2 次重復。RNA 測序由中國科學院上海生命科學研究院計算生物學研究所多維組學數據平臺的Illumina Hiseq X Ten 測序儀完成，使用Qubit Fluorometer 和Agilent Bioanalyzer 2100 RNA 6000 Chip 2 種方法評估RNA 的完整性，RNA 完整值均大于7.1，說明完整性較好。利用TopHat2 軟件將RNA 測 序 數 據 與GRCm38（genome reference consorium m38）（http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index）小鼠基因組進行比對，通過Cufflinks 軟件對Mapped Reads進行拼接，并與原有的基因組注釋信息進行比較。表達定量軟件RSEM 用于對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，定量指標為FPKM （fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）。CD169+/CD169-亞群的差異基因由DESeq2 軟件對原始計數進行分析。當P＜0.05且|log2FC|≥1 時認為該基因表達差異顯著。所有分析均基于美吉生物云平臺（https://www.i-sanger.com/）進行。

1.2.5 數據分析 對CD169+、CD169-2 個亞群細胞基因集進行分析，韋恩圖顯示亞群間共有或特有的表達基因數目。主成分分析（principal component analysis，PCA）體現出樣本間的相似性；各個樣本點的距離代表了樣本的距離，距離越近表明樣本間相似性越高。熱圖是對2 個亞群細胞差異表達的基因進行表達模式聚類分析。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes，KEGG）功能分析用于系統分析基因功能，可將基因集中的基因按照參與的通路或行使的功能分類[21]。

1.2.6 qPCR 驗證差異表達基因 將CD169+和CD169-紅髓巨噬細胞的RNA 用HifairTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 即用型預混液反轉錄得到cDNA，選取8 個KEGG 通路分析中富集的差異表達基因進行qPCR 驗證，結果分析用2-ΔΔCT法。所用的引物序列（表1）通過PrimerBank 搜索得到。

表1 qPCR 所用的引物序列Tab 1 Sequences of primers for qPCR

1.3 統計學方法

采用 GraphPad Prism 7.0 軟件對研究數據進行統計學分析及作圖。定量資料以±s 表示，采用t 檢驗或校正t 檢驗進行CD169+和CD169-亞群細胞比例的差異比較。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 部分RpMΦ 表達CD169

為了驗證野生型（wild type，WT）小鼠部分RpMΦ表達CD169 分子，本研究先利用流式細胞術檢測WT小鼠和CD169 KO 小鼠脾中RpMΦ 的比例，再比較RpMΦ 中CD169 分子的表達情況。根據已有的研究[22-23]表明，F4/80+CD11b-可作為RpMΦ 的表面標志物。因此，如流式細胞術策略（圖1A）所示，在圈選了脾細胞并去黏連后，F4/80+CD11b-細胞群即為RpMΦ。結果顯示，CD169 KO 小鼠脾內RpMΦ 的比例與WT 小鼠相似（圖1B），2 組小鼠RpMΦ 占脾細胞的比例均在0.5%～1.5%，差異無統計學意義（圖1C）；但以CD169 KO 小鼠作為陰性對照，在WT 小鼠RpMΦ 中可明顯地觀察到部分RpMΦ 表達CD169 分子（圖1B、D）。

圖1 WT 小鼠和CD169 KO 小鼠中CD169+ RpMΦ 比例Fig 1 Proportion of CD169+ RpMΦ in WT and CD169 KO mice

2.2 CD169+ RpMΦ 的空間分布

為進一步確認CD169 在小鼠脾RpMΦ 中的表達，本研究利用免疫熒光技術對脾RpMΦ 上CD169 表達情況進行檢測，結果（圖2）顯示，在白色虛線內側邊緣（邊緣區）存在一圈高表達CD169（紅色）的MMMΦ；在脾紅髓中CD169 呈散在分布，并與部分F4/80+的RpMΦ 有很好的共定位。由此再次證實，部分RpMΦ 可表達CD169分子。同時，結果還發現F4/80 主要分布于圓形區域以外的紅髓區域，在邊緣區有微量的表達，但其熒光強度明顯低于紅髓區域。

圖2 免疫熒光法檢測WT 小鼠脾內CD169+ RpMΦ 分布（×20）Fig 2 Locolization of CD169+ RpMΦ of spleen in WT mouse by immunofluorescence (×20)

2.3 CD169+和CD169-紅髓巨噬細胞差異表達基因分析

為探究CD169+RpMΦ 與CD169-RpMΦ 在基因表達水平的差異，本研究通過富集RpMΦ，分選出CD169+和CD169-2 個亞群，提取RNA 并進行測序分析。在CD169+RpMΦ 群中檢測到9 234 個基因，CD169-RpMΦ群中檢測到9 812 個基因，其中共同表達的基因有8 866個（圖3A）。主成分分析顯示，2 群細胞可以被很好地區分開（圖3B）。對差異基因進行聚類分析顯示，共有485個差異表達基因，且相比于CD169+RpMΦ，在CD169-RpMΦ 中的上調基因為427 個，下調基因為58 個（圖3C）。如表達量差異散點圖所示，Siglec1（編碼CD169的基因）在CD169+RpMΦ 群中高表達（圖3D），認為RNA 測序結果與分選策略一致；同時，2 群細胞共同表達小鼠脾RpMΦ 的特征基因，如Vcam1、Axl、Spic、Cd68和Ccr3 等，表明這2 群細胞均屬于RpMΦ。

圖3 小鼠CD169+ RpMΦ 和CD169- RpMΦ 差異表達基因分析Fig 3 Analysis of differentially expressed genes in CD169+ RpMΦ and CD169- RpMΦ

2.4 CD169-紅髓巨噬細胞的促進炎癥作用

通過對上述RNA 測序的數據分析可知，與CD169+RpMΦ 群相比，在CD169-RpMΦ 群中上調的基因數比下調的基因數多。因此，我們將重點放在CD169-RpMΦ 中上調的基因集上，并對該基因集進行KEGG 功能分析。結果（圖3E）顯示，差異表達基因在介導炎癥（綠色方框顯示）和糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）生物合成（紅色方框顯示）的通路中顯著富集，提示CD169-RpMΦ與CD169+RpMΦ 的功能有所不同。其中與介導炎癥相關的通路包括Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 信 號 通 路 及NOD 樣 受 體（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）信號通路。與GAGs 生物合成相關的通路包括硫酸軟骨素/硫酸 皮 膚 素（chondroitin sulfate/dermatan sulfate，CS/DS）、硫酸乙酰肝素/肝素（heparan sulfate/heparin，HS/H）、硫酸角質素（keratan sulfate，KS）以及乳酸。對GAGs 生物合成相關通路中高表達的基因進行分析，發現這些基因均用于編碼糖基或磺基轉移酶。而目前關于GAGs 的研究表明，這些GAGs 修飾酶的基因可以被促炎性細胞因子上調表達進而改變GAGs 的表面結構。這些結構的改變可以為不同種類的分子（包括炎癥介質）提供大量的結合位點，從而促進炎癥進程[24]。結合CD169-RpMΦ 還在炎癥相關通路中富集，我們推測CD169-RpMΦ 可能與介導炎癥 有關。

為了進一步驗證RNA-Seq 的結果，我們挑選了8 個在上述多種通路中的富集基因（表2）。采用qPCR 分別檢測了GAGs 生物合成通路中的 Chst3、Hs3st1 和Xylt1，以及TLR 信號通路、VEGF 信號通路及NLR 信號通路中的Card6、Pstpip1、Akt3、Ccl3 和Ccl4 的表達水平。結果（圖4）顯示，與CD169+RpMΦ 群相比，上述8 個基因在CD169-RpMΦ 群中顯著上調。

表2 CD169- RpMΦ 亞群中不同通路的差異表達基因Tab 2 Differentially expressed genes in different pathways of CD169- RpMΦ

圖4 qPCR 證實部分RNA 測序結果中的差異表達基因Fig 4 Validation of differentially expressed genes in RNA-sequencing by qPCR

3 討論

組織駐留巨噬細胞的異質性一直是免疫學研究的熱點問題。即使目前巨噬細胞已獲得大致分類，由于組織駐留巨噬細胞在同一個組織內占據著多個局部微環境，在已知的巨噬細胞種群中仍不斷發現具有微環境特異性表型和功能的亞群。例如近期有研究指出肺間質巨噬細胞（interstitial macrophages，IMs）仍存在異質性，它們可以分成2 群具有不同基因表達譜和表型的亞群，一組與傷口愈合有較高的關聯性，另一組則具有更強的抗原遞呈能力。在心臟、脂肪和真皮中也存在類似的亞群[25]。

鑒于RpMΦ 是一群擁有清除破損紅細胞、調節鐵循環、介導炎癥反應、抵抗寄生蟲感染及調節免疫反應等復雜功能的細胞群，我們猜測RpMΦ 中可能也存在不同分工的亞群。CD169 分子在限制病毒擴散[26]、介導T 細胞反應[27]和調節免疫反應[28]等方面有重要的作用。本研究利用流式細胞術和免疫熒光法證實了CD169 在部分RpMΦ 中表達。因此我們推測存在以CD169 表達量分型的RpMΦ 亞群，它們以互補的方式參與控制感染并誘導有效的免疫反應。

通過對于RNA 測序數據的進一步分析，本研究發現在CD169-RpMΦ 中高表達的且能夠在介導炎癥及GAGs生物合成相關通路中富集的差異表達基因，多與招募炎癥細胞、推進免疫進程有關。例如，在GAGs 生物合成通路中富集的基因Chst3 是引起炎癥和白細胞趨化的一種碳水化合物磺基轉移酶。它可合成6-硫酸軟骨素，而硫酸軟骨素蛋白聚糖是重要的炎癥介質。有研究[29]發現，利用小干擾RNA 使Chst3 沉默后，肺泡灌洗液和肺實質中巨噬細胞的數量減少，同時腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的表達被抑制。類似地，在TLRs 信號通路中富集的Ccl3 和Ccl4 基因能夠編碼免疫細胞招募的分子巨噬細胞炎癥蛋白1α/β（macrophage inflammatory protein-1α/β，MIP-1α/β）。而MIP-1α/β 在 誘導Th1 型反應后會被大量釋放[30-31]，與T 細胞、樹突狀細胞、B 細胞和嗜酸性粒細胞上的CC 趨化因子受體1（CC chemokine receptors 1，CCR1）、CCR4 和CCR5 受 體 結合，招募免疫細胞浸潤，是炎癥反應期間募集細胞的重要組成部分[32]。這些分析結果均指向CD169-RpMΦ 擁有介導炎癥、招募免疫細胞的能力。

巨噬細胞被廣泛認為可以分為M1 MΦ 和M2 MΦ 2 種極化類型。巨噬細胞在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、干 擾 素-γ（interferon-γ，IFN-γ）及 粒 細 胞- 巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的刺激后可極化為M1 MΦ，產生炎性細胞因子，例如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23 和TNF-α 等，從而介導炎癥，引起組織損傷。另一方面，巨噬細胞還可以被IL-4 和IL-13 轉變為M2 MΦ，產生抗炎性細胞因子IL-10 和TGF-β，以限制炎癥發展、促進組織修復[33]。通過與小鼠M1 和M2 巨噬細胞中存在的特征差異表達基因集[34]進行比對，我們發現CD169-RpMΦ 中無M2 型特征基因，但有6 個M1 型特征基因，它們分別是Gpr18、Itgal、Oasl1、H2-Q6、H2-T10 和Arhgap24。 結合上述對于單個通路內上調的基因的分析，本研究的結果提示CD169-RpMΦ 是一群擁有M1 傾向的RpMΦ。

關于RpMΦ 亞群的研究仍存在許多問題亟待解決。首先，現已知組織特異性轉錄因子和譜系特異性轉錄因子共同形成了控制網絡，控制組織駐留巨噬細胞的基因表達，從而塑造了不同巨噬細胞亞群的獨特表達譜[35]，但對于影響RpMΦ 亞群表型至關重要的脾微環境因素仍不明確。通過將蛋白質組學、代謝組學、基因組學及表觀基因組學與計算機模擬算法相結合，可以極大地幫助我們了解RpMΦ 生物功能的全貌。其次，關于CD169-RpMΦ 的功能目前只在基因表達水平上進行了檢測，還需要更多體內和體外的功能實驗證實本文關于CD169-RpMΦ 數據的分析結論。

結合RNA 測序結果，CD169-RpMΦ 中部分GAGs修飾酶的表達量上調。而目前已知M1/M2 型巨噬細胞中許多GAGs 修飾酶的表達發生改變，并伴隨獨特結構特征的GAGs 表達[36]。這說明GAGs 修飾酶可能通過改變GAGs 的結構誘導炎癥因子的釋放，或通過調節它們與靶膜上同源受體的結合，影響巨噬細胞的可塑性。GAGs 的結構重塑是炎癥發生的原因還是后果仍不清楚。如果是后者，通過抗炎治療可以恢復正常的聚糖結構和功能。相反，如果GAGs 的生物合成失調直接與疾病發生相關，則可以將GAGs 修飾酶作為疾病治療的潛在靶點。

綜上所述，通過流式細胞術和免疫熒光法2 種手段證實，在小鼠脾中有部分RpMΦ 表達CD169。隨后，我們根據CD169 表達量將RpMΦ 分為2 個亞群后發現，與CD169+RpMΦ 相比，CD169-RpMΦ 參與介導炎癥反應，具有M1 MΦ 傾向。RpMΦ 對于多種細菌或寄生蟲感染、疾病的病理變化和組織重構過程有著重要的作用。因此，RpMΦ 異質性的研究結果將更好地揭示免疫系統的協同工作，從而為人工干預免疫反應提供臨床指導依據。

參·考·文·獻

[1] Mebius RE, Kraal G. Structure and function of the spleen[J]. Nat Rev Immunol, 2005, 5(8): 606-616.

[2] den Haan JM, Mebius RE, Kraal G. Stromal cells of the mouse spleen[J]. Front Immun, 2012, 3: 201.

[3] Kurotaki D, Uede T, Tamura T. Functions and development of red pulp macrophages[J]. Microbiol Immunol, 2015, 59(2): 55-62.

[4] dos Anjos Cassado A. F4/80 as a major macrophage marker: the case of the peritoneum and spleen[M]//Kloc M. Results and problems in cell differentiation. Cham: Springer International Publishing, 2017: 161-179.

[5] Davies LC, Jenkins SJ, Allen JE, et al. Tissue-resident macrophages[J]. Nat Immunol, 2013, 14(10): 986-995.

[6] Haldar M, Kohyama M, So AY, et al. Heme-mediated SPI-C induction promotes monocyte differentiation into iron-recycling macrophages[J]. Cell, 2014, 156(6): 1223-1234.

[7] Hashimoto D, Chow A, Noizat C, et al. Tissue-resident macrophages selfmaintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes[J]. Immunity, 2013, 38(4): 792-804.

[8] Murray PJ, Wynn TA. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(11): 723-737.

[9] Lavin Y, Mortha A, Rahman A, et al. Regulation of macrophage development and function in peripheral tissues[J]. Nat Rev Immunol, 2015, 15(12): 731-744.

[10] Gautier EL, Shay T, Miller J, et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages[J]. Nat Immunol, 2012, 13(11): 1118-1128.

[11] Okabe Y, Medzhitov R. Tissue-specific signals control reversible program of localization and functional polarization of macrophages[J]. Cell, 2014, 157(4): 832-844.

[12] Perez OA, Yeung ST, Vera-Licona P, et al. CD169+macrophages orchestrate innate immune responses by regulating bacterial localization in the spleen[J]. Sci Immunol, 2017, 2(16): eaah5520.

[13] Kohyama M, Ise W, Edelson BT, et al. Role for Spi-C in the development of red pulp macrophages and splenic iron homeostasis[J]. Nature, 2009, 457(7227): 318-321.

[14] Taylor PR, Martinez-Pomares L, Stacey M, et al. Macrophage receptors and immune recognition[J]. Annu Rev Immunol, 2005, 23(1): 901-944.

[15] Kim CC, Nelson CS, Wilson EB, et al. Splenic red pulp macrophages produce type Ⅰ interferons as early sentinels of malaria infection but are dispensable for control[J]. PLoS One, 2012, 7(10): E48126.

[16] Kurotaki D, Kon S, Bae K, et al. CSF-1-dependent red pulp macrophages regulate CD4 T cell responses[J]. J Immunol, 2011, 186(4): 2229-2237.

[17] Crocker PR, Gordon S. Properties and distribution of a lectin-like hemagglutinin differentially expressed by murine stromal tissue macrophages[J]. J Exp Med, 1986, 164(6): 1862-1875.

[18] van Dinther D, Veninga H, Iborra S, et al. Functional CD169 on macrophages mediates interaction with dendritic cells for CD8+T cell cross-priming[J]. Cell Rep, 2018, 22(6): 1484-1495.

[19] Wu C, Rauch U, Korpos E, et al. Sialoadhesin-positive macrophages bind regulatory T cells, negatively controlling their expansion and autoimmune disease progression[J]. J Immunol, 2009, 182(10): 6508-6516.

[20] Klaas M, Oetke C, Lewis LE, et al. Sialoadhesin promotes rapid proinflammatory and type Ⅰ IFN responses to a sialylated pathogen, Campylobacter jejuni[J]. J Immunol, 2012, 189(5): 2414-2422.

[21] Kanehisa M, Goto S, Sato Y, et al. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(Database issue): D109-D114.

[22] A-Gonzalez N, Castrillo A. Origin and specialization of splenic macrophages[J]. Cell Immunol, 2018, 330: 151-158.

[23] Taylor PR, Brown GD, Geldhof AB, et al. Pattern recognition receptors and differentiation antigens define murine myeloid cell heterogeneity ex vivo[J]. Eur J Immunol, 2003, 33(8): 2090-2097.

[24] Groux-Degroote S, Cavdarli S, Uchimura K, et al. Glycosylation changes in inflammatory diseases[J]. Adv Protein Chem Struct Biol, 2020, 119: 111-156.

[25] Chakarov S, Lim HY, Tan L, et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches[J]. Science, 2019, 363(6432): eaau0964.

[26] Sewald X, Ladinsky MS, Uchil PD, et al. Retroviruses use CD169-mediated trans-infection of permissive lymphocytes to establish infection[J]. Science, 2015, 350(6260): 563-567.

[27] van Dinther D, Lopez Venegas M, Veninga H, et al. Activation of CD8+T cell responses after melanoma antigen targeting to CD169-antigen presenting cells in mice and humans[J]. Cancers (Basel), 2019, 11(2): E183.

[28] Wu Y, Lan C, Ren DR, et al. Induction of siglec-1 by endotoxin tolerance suppresses the innate immune response by promoting TGF-β1 production[J]. J Biol Chem, 2016, 291(23): 12370-12382.

[29] Kai Y, Tomoda K, Yoneyama H, et al. RNA interference targeting carbohydrate sulfotransferase 3 diminishes macrophage accumulation, inhibits MMP-9 expression and promotes lung recovery in murine pulmonary emphysema[J]. Respir Res, 2015, 16: 146.

[30] Canque B, Rosenzwajg M, Gey A, et al. Macrophage inflammatory protein-1alpha is induced by human immunodeficiency virus infection of monocytederived macrophages[J]. Blood, 1996, 87(5): 2011-2019.

[31] Lukacs NW, Strieter RM, Elner VM, et al. Intercellular adhesion molecule-1 mediates the expression of monocyte-derived MIP-1 α during monocyteendothelial cell interactions[J]. Blood, 1994, 83(5): 1174-1178.

[32] Annunziato F, Galli G, Nappi F, et al. Limited expression of R5-tropic HIV-1 in CCR5-positive type 1-polarized T cells explained by their ability to produce RANTES, MIP-1α, and MIP-1β[J]. Blood, 2000, 95(4): 1167-1174.

[33] Borges da Silva H, Fonseca R, Pereira RM, et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease[J]. Front Immunol, 2015 (9), 22;6: 480.

[34] Jablonski KA, Amici SA, Webb LM, et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages[J]. PLoS One, 2015, 10(12): E0145342.

[35] Lavin Y, Winter D, Blecher-Gonen R, et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment[J]. Cell, 2014, 159(6): 1312-1326.

[36] Martinez P, Denys A, Delos M, et al. Macrophage polarization alters the expression and sulfation pattern of glycosaminoglycans[J]. Glycobiology, 2015, 25(5): 502-513.