利拉魯肽作用腸道固有淋巴細胞改善小鼠炎癥性腸病

李 月 ，孫寒曉，殳 潔，李詠梅，盛慧明#

1. 北華大學醫學院，吉林132013；2. 上海交通大學醫學院附屬同仁醫院檢驗科，上海200336

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性炎癥性腸道疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）[1]。流行病學顯示IBD 發病率在亞洲國家和其他發展中國家呈逐年上升趨勢[2]，嚴重影響患者的生活質量。目前，其發病機制尚未完全明確[3]，臨床上并無完全治愈IBD 的有效治療手段。因此，進一步探討IBD 的發病機制，尋找新的防治策略和干預靶點是目前亟待解決的關鍵問題。

胰高血糖素樣肽-1 受體激動劑（glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA）是目前治療2 型糖尿病的有效藥物，且經FDA 批準使用的GLP-1RA 主要有利拉魯肽、艾塞那肽等[4]。研究[5]表明利拉魯肽不僅具有血糖調節作用，還具有抗炎等特性，但關于利拉魯肽參與腸道炎癥的抗炎作用研究甚少。

隨著對IBD 的作用機制的深入研究，人們逐漸聚焦到了一類新的免疫細胞——固有淋巴細胞（innate lymphoid cell，ILC）。ILC 是一類與T 淋巴細胞表型和功能相似的天然免疫細胞[6]。ILC 家族主要分為3 個亞群，分別是 1 型ILC（group 1 ILC，ILC1）和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK） 細 胞、2 型ILC（group 2 ILC，ILC2）、淋巴組織誘導細胞和3 型ILC（group 3 ILC，ILC3）[7-8]。ILC 可分泌細胞因子，主要通過與間質細胞以及其他免疫細胞之間的相互作用在IBD 等多種自身免疫性疾病中發揮效應[9]。研究[10-11]顯示ILC 參與腸道黏膜穩態的調節，并在IBD 的發生和發展中起著重要的作用。

葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠結腸炎模型所致臨床和病理特征與人類IBD 相似，因此是研究IBD 常用的動物疾病模型[12-13]。本研究通過對C57BL/6 小鼠進行DSS 誘導構建小鼠IBD 模型，應用利拉魯肽進行治療，從小鼠的糞便性狀、結腸外觀和病理改變、免疫細胞數量以及炎性細胞因子的表達等方面評估利拉魯肽對DSS 誘導IBD 小鼠的作用，以期為輔助治療IBD 提供新的理論和實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物 6 ～10 周齡C57BL/6 野生型雌性小鼠，體質量16 ～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。所有小鼠均飼養在中國科學院上海生命科學研究所SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號為（滬）SYXK2019-0001。飼養條件如下：動物房室內溫度18 ～22 ℃，相對濕度50%～60%，分籠飼養，自由攝食飲水，適應環境后進行實驗。動物實驗均得到中國科學院上海生命科學研究所醫學研究倫理委員會批準。

1.1.2 實驗儀器 GalliosTM流式細胞儀（美國貝克曼公司），ECLIPSE 80i 顯微鏡（日本尼康公司），ZHWY-100H經典型多振幅軌道搖床（中國智城分析儀器制造有限公司），Eppendorf AG 22331 Hamburg 低速離心機（德國艾本德公司）。

1.1.3 實驗試劑 FITC 標記的CD3e 抗體、CD11b 抗體、CD11c 抗體、B220 抗體、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF）抗體，PE 標記的白介素-5 （interleukin-5，IL-5）抗體，APC 標記的視黃酸相關的孤兒受體γt （retinoid-related orphan receptor γt，RORγt） 抗 體，PerCP-Cy5.5 標 記 的CD11b 抗體、IL-17A 抗體，PE-Cy7 標記的IL-13 抗體、CD3e 抗體、CD11b 抗體（美國eBioscience 公司）；PE 標記的Siglec-F（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin F）抗體，APC 標記的GATA3（GATA binding protein 3）抗 體、Ly6G（lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6D）抗體（美國BD Biosciences 公司）；PE 標記的IL-22抗體，PE-Cy7 標記的CD11c 抗體，CD16/32 抗體（美國Biolegend 公司）；PE-Cy7 標記的B220 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公 司 ）。PMA（phorbol-12-myristate-13-acetate）（美國Sigma 公司，貨號H9268-10G），離子霉素（美國Sigma 公司，貨號10004974-1），布雷菲德菌素A（美國Sigma 公司，貨號11861-5），LIVE/DEAD?固定式死細胞染色試劑盒（美國Invitrogen 公司，貨號L34955），Foxp3/轉錄因子染色緩沖液（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號00-5523-00），蘇木精- 伊紅（hematoxylineosin，H-E）染色試劑盒（中國碧云天公司，貨號C0105），DSS（美國MP Biomedicals 公司，貨號160110），利拉魯肽諾和力注射液（丹麥諾和諾德公司，規格18 mg/3 mL），二硫蘇糖醇（美國Promega 公司，貨號V3155），乙二胺四乙酸（美國Invitrogen 公司，貨號25200-072），胎牛血清（美國GEMINI 公司，貨號900-108），脫氧核糖核酸酶Ⅰ（美國Sigma 公司，貨號DN25-1G），膠原酶Ⅷ（美國Sigma 公司，貨號C2139-500M），RPMI 1640 培養基（美國Invitrogen 公司，貨號22409015），Percoll 細胞分離液（德國Amersham/GE 公司，貨號17089102）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型構建 適應性喂養7 d 后，隨機選取20 只小鼠分為4 組，每組5 只，分別為對照組、利拉魯肽組、模型組和治療組。對照組小鼠每日飲用無菌水，并腹腔注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；利拉魯肽組小鼠每日飲用無菌水，并腹腔注射利拉魯肽；模型組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無菌水溶液，并腹腔注射PBS；治療組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無菌水溶液，并腹腔注射利拉魯肽。注射液現用現配，PBS 劑量0.6 mg/ （kg·d），利拉魯肽劑量0.6 mg/ （kg·d），共處理7 d。每日觀察并記錄小鼠體質量、糞便形態以及有無便血等情況，判斷結腸炎嚴重程度。

1.2.2 小鼠腸道固有層細胞的提取 無菌環境下取小鼠結腸，PBS 洗滌后，室溫下在含有1 mmol/L 二硫蘇糖醇的PBS 中振搖10 min，經PBS 洗滌，在含有30 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS 中于37 ℃振蕩孵育10 min，重復 2 次。加入含有1% 胎牛血清、脫氧核糖核酸酶Ⅰ和膠原酶Ⅷ的RPMI 1640 培養液，在37 ℃、5% CO2的培養箱消化1.5 h 后，劇烈搖動組織勻漿，使其通過100 μm 細胞過濾器，室溫以1 048×g 離心20 min 后，從80%和40% Percoll 梯度液的中間層收獲腸道固有層細胞。

1.2.3 流式細胞術分析 腸道固有層譜系（lineage，Lin）標志物包括CD3e、B220、CD11b 和CD11c。應用流式細胞術檢測小鼠結腸內的中性粒細胞（CD11b+Ly6G+）、嗜酸 性 粒 細 胞（CD11b+Siglec-F+）、ILC2（Lin-GATA3+）和ILC3（Lin-RORγt+），以評估腸炎的嚴重程度。將分離出的腸道固有層細胞，用50 ng/mL PMA 和500 ng/mL 離子霉素刺激4 h，在收獲細胞前2 h 添加2 μg/mL 布雷菲德菌素A。收集細胞，使用CD16/32 抗體室溫孵育5 min，然后稀釋CD3e 抗體、B220 抗體、CD11b 抗體、CD11c抗體、Siglec-F 抗體和Ly6G 抗體，4 ℃孵育30 min 進行細胞表面蛋白的染色。經PBS 洗滌后，根據說明書使用Foxp3/轉錄因子染色緩沖液將細胞進行固定透化，胞內轉錄因子（GATA3、 RORγt）、細胞因子（IL-5、 IL-13、IL-17、IL-22 和GM-CSF） 于4 ℃孵 育45 min，PBS 洗滌重懸后經GalliosTM流式細胞儀檢測分析，數據經Flow JoV10 軟件分析。

1.2.4 組織學分析 取小鼠肛門以上1 cm 處的結腸組織，長約0.5 cm，PBS 洗滌后用4%多聚甲醛固定24 h，將組織包埋在石蠟中，制備5 μm 厚度的組織切片，進行H-E 染色。使用光學顯微鏡隨機選取3 個視野，觀察結腸的病理改變。根據黏膜層炎癥細胞浸潤程度（1 ～3 分）、肌層炎癥細胞浸潤程度（0 ～2 分）、杯狀細胞缺失情況（0 ～2 分）、黏膜糜爛至潰瘍程度（0 ～2 分）等4 個方面，采用盲法進行組織病理學分析并評分，最高得分為 9 分[14]。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計學分析，定量資料用±s 表示，組間比較采用非配對Student's t 檢驗。P＜0.05 時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導的IBD 小鼠結腸損傷

實驗第5 日，模型組小鼠體質量較第1 日下降12.23%，第6 ～7 日體質量繼續下降。實驗過程中觀察到小鼠有稀便甚至血便現象，視為建模成功。模型組小鼠腸道內血便情況較為嚴重，而治療組血便情況相對較輕。實驗第5 日，與對照組相比，模型組小鼠體質量明顯降低（P=0.014）；處理7 d 后，與模型組相比，治療組小鼠體質量下降明顯緩解（P=0.043）（圖1A）。小鼠結腸長度比較結果顯示，模型組小鼠結腸長度明顯短于對照組（P=0.008）；而治療組與模型組相比，結腸縮短情況明顯緩解（P=0.007）（圖1B、C）。

圖1 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導的IBD 小鼠結腸損傷Fig 1 Liraglutide significantly alleviated colon injury induced by DSS in IBD mice

2.2 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導的IBD 小鼠結腸黏膜屏障損傷

H-E 染色結果顯示，模型組小鼠黏膜上皮細胞大量壞死脫落，杯狀細胞缺失，黏膜下層存在淋巴細胞重度浸潤，幾乎沒有完整的黏膜結構（圖2A）。而經過利拉魯肽處理后，組織學損傷得到了明顯改善，結腸組織結構、固有層腸腺、黏膜肌層相對完整，黏膜下層輕中度淋巴細胞浸潤。組織病理學評分顯示，與對照組相比，模型組小鼠評分明顯升高（P=0.008）；而經過利拉魯肽處理后，評分明顯降低（P=0.008）（圖2B）。

圖2 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導的IBD 小鼠結腸黏膜屏障損傷Fig 2 Liraglutide significantly alleviated the colonic mucosal barrier injury induced by DSS in IBD mice

2.3 利拉魯肽改善DSS 誘導的IBD 小鼠結腸內炎癥細胞浸潤

應用流式細胞術檢測小鼠結腸內嗜酸性粒細胞和中性粒細胞比例，以評估腸炎的嚴重程度，其分選策略如圖3A所示。結果（圖3B ～E）顯示模型組小鼠結腸內嗜酸性粒細胞、中性粒細胞比例明顯高于對照組（均P=0.001），經過利拉魯肽處理后，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例較模型組顯著降低（P=0.004，P=0.002），說明利拉魯肽能夠改善DSS 誘導的IBD 小鼠結腸內炎癥細胞的浸潤。

圖3 利拉魯肽改善DSS 誘導的IBD 小鼠結腸內炎癥細胞浸潤Fig 3 Liraglutide improved the colonic inflammatory cell infiltration induced by DSS in IBD mice

2.4 利拉魯肽影響DSS 誘導的IBD 小鼠腸道ILC 的變化

應用流式細胞術檢測小鼠結腸ILC2、ILC3 及其分泌的細胞因子（分選策略如圖4A、B 所示），評估利拉魯肽處理前后ILC2、ILC3 數量和功能的變化。結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠結腸內ILC2 占總ILC 的比例升高（P=0.032），而經過利拉魯肽處理后ILC2 比例較模型組降低（P=0.032），提示利拉魯肽可抑制結腸內ILC2 的數量（圖4C）；但通過比較模型組與治療組之間ILC2 分泌的主要細胞因子IL-5、IL-13、IL-17 的水平，未發現差異有統計學意義（結果未顯示）。與模型組相比，治療組ILC3 的比例明顯增加（P=0.008）（圖4D），其IL-22 的分泌水平亦明顯升高（P=0.008）（圖4E），但2 組間其他細胞因子IL-17、GM-CSF 分泌水平的差異無統計學意義（結果未顯示）。

圖4 利拉魯肽影響DSS 誘導的IBD 小鼠腸道ILC 的變化Fig 4 Liraglutide affected the intestinal ILC of IBD mice induced by DSS

3 討論

本研究通過分析小鼠的體質量變化、結腸長度以及結腸的病理學改變、免疫細胞數量，明確利拉魯肽可延緩DSS 誘導的小鼠IBD 的發生發展。對結腸內ILC 及其分泌的細胞因子分析后發現，經利拉魯肽處理后，DSS 誘導的IBD 小鼠結腸內ILC2 比例明顯降低，ILC3 比例明顯升高，且ILC3 分泌的細胞因子IL-22 的水平顯著增加。

ILC3 主要存在于腸黏膜組織中，表達轉錄因子RORγt， 主要分泌IL-22、IL-17 和GM-CSF 等細胞因子，在黏膜穩態和炎癥反應中起重要作用[15]。IL-22 信號會誘導黏蛋白產生，還可通過促進上皮細胞的增殖和存活來促進組織修復。此外，IL-22 還能促進核苷酸寡聚結構域蛋白2（nucleotide oligomerization domain-containing protein 2，NOD2）產生，而NOD2 信號的激活也可促進黏蛋白分泌，保護腸上皮細胞免受細菌侵襲。ILC3 產生的IL-22 可與腸上皮細胞表達的受體結合，通過激活蛋白酪氨酸激酶-信號轉導子與轉錄激活子（just another kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號通路，促進上皮細胞增殖，從而使上皮屏障保持完整性[16]。同時，IL-22 可以誘導產生抗微生物因子Reg（ regenerating） - Ⅲβ 和Reg- Ⅲγ，限制共生菌與上皮細胞接觸，避免腸道炎癥產生[17]。在本研究中，利拉魯肽作用后，腸固有層ILC3 比例及IL-22 的分泌明顯增加，說明IL-22 可能通過以上方式在腸道黏膜免疫系統的調節中發揮重要作用。

ILC2 主要分布在腸道、肺部、淋巴組織、肝臟和腸系膜中[18]，主要分泌Ⅱ型細胞因子如IL-4、IL-5 和IL-13等。GATA3 是ILC2 的主要轉錄因子[19]，是ILC2 發育、存活和功能發揮的關鍵調控因子[20]。在唑酮誘導的小鼠結腸炎模型中，ILC2 由于受到IL-25 的刺激，可加速促進腸道炎癥[21]。在新確診的IBD 患者中，疾病早期病變處腸黏膜內ILC2 比例明顯增加[22]，提示ILC2 可能在IBD中發揮促進炎癥的作用。另有研究[23]發現GLP-1RA 可作用于自身免疫性疾病，如抑制IL-33 的釋放以及過敏氣道炎癥，推測GLP-1RA 可能是治療ILC2 介導的過敏性哮喘的一種新手段。結合本研究結果，GLP-1RA 利拉魯肽可能通過抑制腸道ILC2 從而改善DSS 誘導的小鼠IBD，但其具體機制尚需進一步研究。

近年來研究[24]發現，ILC 與輔助性T 細胞類似，具有一定的可塑性。ILC2 在發育和維持過程中可能向ILC3 轉化，炎性ILC2 可能分化產生IL-17 的ILC3 樣細胞[25]。在人類CD 患者的腸樣本中發現ILC2 分泌的IL-13 和γ- 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）明顯增加[26]，說明炎性ILC3 可能轉變為分泌IFN-γ 的ILC2 樣細胞。同時本實驗中ILC2比例降低伴ILC3 比例升高也提示，存在ILC2 向ILC3 轉化的可能性。既往研究表明ILC2 分泌的IL-4 對于抵抗細胞外寄生蟲感染的保護性免疫至關重要[27]，同時也與IBD的嚴重程度有關[28]。所以利拉魯肽是否影響ILC2 分泌IL-4，進而減緩疾病的進程仍需后續研究進一步明確。

此外，本研究仍具有一定的局限性：首先，DSS 誘導的IBD 小鼠模型僅模仿了UC 患者一些典型的組織病理學特征和某些免疫學特征，并不能完全代表CD 的復雜特征；其次，樣本例數較少。因此，迫切需要開發能夠解決現有局限性且更接近CD 和UC 特征的其他實驗模型[29]，并增加研究病例數以明確實驗結論。

綜上，本研究發現GLP-1RA 利拉魯肽可能作用于腸道ILC，明顯延緩DSS 誘導的IBD 小鼠的疾病發生與發展，為利拉魯肽的潛在治療用途提供了理論依據。

參·考·文·獻

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