子宮內膜癌中長鏈非編碼RNA 表達譜的生物信息學分析

建方方，車曉霞，馮煒煒

1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院婦產科，上海 200025；2. 復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200011

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系統中常見的三大惡性腫瘤之一，其在女性生殖道惡性腫瘤中占比20%～30%，在女性惡性腫瘤中占比約7%。據2016 年流行病學統計顯示，在全球范圍內該疾病每年約有320 000 例新發病例、76 000 例死亡病例，嚴重威脅著女性的生命健康[1]。目前，臨床上針對EC 的治療手段主要有手術、化學治療及放射治療等，但上述方法對晚期及復發患者而言，治療效果并不理想。因此，全面了解EC 發病的分子機制對其臨床治療的開展具有舉足輕重的作用。

長 鏈 非 編 碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉錄物長度超過200 個核苷酸的RNA，其本身不編碼蛋白質，而是以RNA 的形式在多種層面上調控基因的表達，參與多種生物學功能的發揮[2]。越來越多的證據表明，lncRNAs 可在人類腫瘤組織中異常表達，并在腫瘤的發生及發展過程中起促癌或抑癌作用[3]。研究[4]表明，HOTAIR 在EC 中高表達，且和腫瘤分期、子宮肌層浸潤以及淋巴轉移有關。Guo 等[5]發現MEG3 在EC 中表達下調，并能夠通過調控Notch 信號通路抑制內膜癌細胞增殖。然而目前已發現的與EC 有關的lncRNAs 相對較少，且其如何在內膜癌組織中發揮作用尚待深入研究。基于此，本研究采用轉錄組測序技術對21 例EC 組織和5 例正常內膜組織進行分析，獲得lncRNAs 和mRNA 的差異表達譜。隨后，僅就lncRNAs 部分進行探討，即通過生物信息分析初步探索lncRNAs 可能涉及的生物學過程及信號通路，以期在轉錄組水平了解EC 中lncRNAs 的表達變化情況，為進一步探索EC 的發病機制及治療靶點提供科學證據。

1 材料與方法

1.1 組織標本

EC 組織標本源于2013 年5 月—2018 年12 月于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院診治的且經術后病理診斷為EC 的患者，共計21 例；其中，高級別腺癌6 例、漿液性癌6 例、內膜樣腺癌8 例和透明細胞癌1 例。正常內膜組織源于同期因異常子宮出血于我院就診的，經診刮及術后病理診斷為處于子宮內膜增生期或分泌期的患者，共計 5 例。本研究已獲得上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會審批。所有被采集的患者均簽署了知情同 意書。

1.2 主要試劑

TRIzol 總RNA 抽提試劑、SuperscriptTMⅢ 反轉錄酶試劑盒及實時熒光定量 PCR 試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，異丙醇、氯仿、無水乙醇、甲醇均購自上海振興化工一廠。

1.3 研究方法

1.3.1 組織標本的RNA 抽提及純化 依據試劑說明書的標準操作流程進行。采用TRIzol 總RNA 抽提試劑提取EC 組織標本及正常內膜組織標本的總RNA，經Agilent Bioanalyzer 2100（美國安捷倫公司）電泳質檢合格后使用RNeasy Micro Kit 和 RNase-Free DNase Set 純化總RNA。而后，經NanoDrop 2000 分光光度計及Agilent Bioanalyzer 2100 對其濃度進行測定，合格的RNA 可用于后續測序實驗。

1.3.2 轉錄組測序及數據分析 本研究數據來源于HiSeq×Ten（美國Illumina 公司），采用150 bp 雙端測序。通過 FASTQC（v0.11.5）軟件對原始數據進行質量評估，使用Cutadapt（v1.10）軟件去除接頭序列，再使用Hisat2（v2.0.5）軟件將讀序比對至基因組（基因組版本為hg19），使用Stringtie（v1.3.3b）軟件進行組裝。使用R 語言中DESeq2 對EC 組織標本及正常內膜組織標本的lncRNAs的差異表達進行分析。基因表達的差異用P 值和差異倍數（fold change，FC）的對數（logFC）表示。設置參數P＜0.05 且|log2FC|＞1 為閾值，篩選差異表達的lncRNAs。對上述獲得的lncRNAs 進行GO（Gene Ontology）功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）通路分析。

1.3.3 反轉錄及實時熒光定量PCR 驗證分析 為了驗證測序結果，本研究將樣本量進行擴大，即納入47 例EC組織標本及19 例正常內膜組織標本，抽提RNA 的步驟見1.3.1。根據反轉錄試劑盒說明，將相關試劑與0.5 μg 總RNA 混合均勻（總體積為20 μL，加入RNA 體積根據濃度計算）進行反應，條件如下：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。而后使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，將1 μL cDNA 與相關試劑混合配置10 μL 反應體系進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）反應，條件如下：90 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共20 個循環。以甘油醛-3-磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh） 為內參，基因的相對量用2-△△CT進行分析。所有數據均進行3 次分析（即設置3 個復孔）。lncRNAs 引物均由上海冠泰生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4 統計學方法

采用 GraphPad Prism 6.0 軟件對研究數據進行統計分析。qPCR 數據以±s 表示，采用t 檢驗進行比較。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達lncRNAs 的篩選

本研究采用R 語言中DESeq2 對EC 組織標本及正常內膜組織標本中的差異表達lncRNAs 進行篩選，并采用聚類熱圖進行分析。結果顯示，共篩選出3 060 個差異表達lncRNAs，其中上調表達2 046 個、下調表達1 014 個 （圖1、表2、表3）；在2 個組織中差異表達10 倍以上的lncRNAs 共859 個，其中上調表達的lncRNAs 占 比75%。

圖1 差異表達lncRNAs 的聚類熱圖Fig 1 Heat map of differentially expressed lncRNAs

表2 表達上調最顯著的前20 個lncRNAsTab 2 Top 20 of the most significant up-regulated lncRNAs

表3 表達下調最顯著的前20 個lncRNAsTab 3 Top 20 of the most significant down-regulated lncRNAs

2.2 qPCR 驗證

為了驗證上述測序結果，本研究隨機篩選了6 個lncRNAs， 包 括3 個 上 調 表 達lncRNAs（LINC01158、SOX21-AS1、HOXC-AS2） 和3 個 下 調 表 達lncRNAs（HAND2-AS1、MEG3、LINC00595），于47 例EC 組 織標本和19 例正常內膜組織標本中進行qPCR 驗證。結果（圖2）顯示，這些lncRNAs 的表達情況和本研究的測序結果相一致，從而證實上述測序結果較為可靠。

圖2 qPCR 檢測EC 組織標本和正常內膜組織標本中6 個lncRNAs 的表達差異Fig 2 Expression differences of 6 lncRNAs in EC tissues and normal endometrial tissues by qPCR

2.3 差異表達lncRNAs 在2 組測序數據中的交集分析

為進一步挖掘參與EC 的發生與發展的重要lncRNAs，本研究結合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中EC 轉錄組測序數據，就差異表達lncRNAs 在本研究轉錄組測序與TCGA 數據庫中的表達差異進行比較分析，結果顯示共有33 個lncRNAs在上述2 組測序數據中均表達上調，包括TFAP2AAS1、SOX21-AS1、SIX3-AS1、RHPN1-AS1、OSTM1-AS1、NAALADL2-AS2、MNX1-AS1、MIR210HG、MIR205HG、 LINC01158、LINC01143、LINC01093、LINC01037、LINC00958、LINC00898、LINC00885、LINC00668、LINC00648、LINC00511、LINC00355、LINC00336、LINC00237、HOXC-AS3、HOXC13-AS、GS1-594A7.3、DLEU7-AS1、CASC9、AFAP1AS1、AC123023.1、AC112721.2、AC106875.1、AC092168.2及AC007128.1；同 時， 有24 個lncRNAs 在 上 述2 組測序數據中均表達下調，包括WT1-AS、PRICKLE2-AS2、NR2F2-AS1、MIR503HG、MIR497HG、MEG3、MEF2C-AS1、MAGI2-AS3、MAGG1-AS1、LINC01140、LINCO1016、LINC00994、LINC00629、JAZF1-AS1、HAND2-AS1、GAS6-AS2、DIO3OS、CTD-2270F17.1、CACNA1G-AS1、ADAMTS9-AS2、 SOCS2-AS1、ACTA2-AS1、AC009110.1 及A2M-AS1。

2.4 GO 功能分析和KEGG 通路分析

為更好地分析差異表達lncRNAs 涉及的生物學過程、分子功能及細胞成分，本研究對差異表達lncRNAs 進行GO 功能分析，結果（圖3）顯示其主要與細胞黏附、免疫反應、炎癥反應及細胞增殖等相關。同時，采用KEGG通路分析對差異表達lncRNAs 進行研究，結果（圖4）顯示其主要富集在PI3K-Akt 信號通路、細胞黏附分子、細胞因子受體等相關通路。

圖3 差異表達lncRNAs 的GO 功能分析Fig 3 GO function analysis of differentially expressed lncRNAs

圖4 差異表達lncRNAs 的KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed lncRNAs

3 討論

既往研究[2]認為，lncRNAs 是RNA 聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學功能。然而，近年來的大量研究[6]表明，lncRNAs 參與了DNA 甲基化、染色質重塑、組蛋白修飾、細胞周期調控、mRNA降解和翻譯調控等多種生物學過程；且部分lncRNAs 還在腫瘤的發生與發展中發揮了重要作用[7]。

目前，鮮少有關于EC 的lncRNAs 的表達譜的相關分析。Chen 等[8]對6 例早期低級別Ⅰ型EC 組織及癌旁組織的lncRNAs 表達譜進行測序分析，研究lncRNAs 的微肽翻譯潛能，結果發現部分lncRNAs 具有微肽翻譯潛力，其可能通過自身翻譯產物發揮調控功能；該研究結合既往卵巢癌及宮頸癌lncRNAs 測序結果，對婦科生殖系統三大腫瘤的差異表達lncRNAs 進行meta 分析，結果顯示部分lncRNAs 在2 種以上腫瘤中均存在差異表達，如在EC 中有4 個特異表達的lncRNAs，包括上調表達的LINC00645、LINC01480 以 及 下 調 表 達 的LINC00702、LINC00891，其中LINC00645 在本研究的測序結果中顯示上調表達近5 倍。Li 等[9]研究發現LINC00645 在腦膠質瘤中表達上調，且與患者的生存率及預后相關；繼而提示，LINC00645 也可能在EC 的發生及發展中扮演了重要角色。

本研究利用轉錄組測序技術分析了21 例EC 組織標本及5 例正常內膜組織標本的lncRNAs 的差異表達譜。結果發現，共篩選出上調表達lncRNAs 2 046 個、下調表達lncRNAs 1 014 個，即在EC 中存在一系列異常表達的lncRNAs，繼而表明lncRNAs 在EC 的發病機制中可能具有潛在作用。同時，有部分lncRNAs 在EC 中的作用已被報道，如H19、MEG3 等[5,8]。另外，本研究的測序結果中還發現了大量新的差異表達lncRNAs，且大部分的lncRNAs 功能尚不清楚。

隨后，本研究采用GO 功能分析和KEGG 通路分析對測序數據進行初步分析。GO 功能分析結果顯示，差異表達lncRNAs 主要涉及的生物學過程包括細胞黏附、免疫反應、炎癥反應及細胞增殖等；繼而提示，免疫及炎癥反應可能在調節EC 生長過程中發揮了重要作用。同時，KEGG 通路分析結果顯示，差異表達lncRNAs 主要與PI3K-Akt 信號通路、腫瘤相關信號通路、細胞黏附分子、細胞因子受體等信號通路，這些所涉及的生物學過程與信號通路均與腫瘤特性相關。

本研究結合TCGA 數據庫中EC 轉錄組測序數據進行分析，結果發現共有57 個lncRNAs 同時在TCGA 數據庫及本研究測序結果中表達上調或下調，提示這些lncRNAs 可能參與EC 的發生；其中，有少數lncRNAs 在EC 的相關研究中已被報道[5,8]，但其是否可作為EC 的特異性lncRNAs 以及診斷、治療的靶標，尚需體內外實驗等進一步驗證。2018 年Yang 等[10]研究發現，HAND2-AS1 在子宮內膜樣癌中的表達顯著下調，且與該疾病的組織分級、轉移及復發相關；且在體外模型中，過表達HAND2-AS1 能明顯抑制EC 細胞的遷移及侵襲。在本研究中，qPCR 驗證結果提示SOX21-AS1 在EC 中表達明顯上調。既往研究[11-13]顯示，SOX21-AS1 在肝癌、結直腸癌、肺癌及宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達上調；且在宮頸癌中SOX21-AS1 甲基化水平有明顯降低，但其表達水平則明顯升高，就臨床樣本分析發現其與國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、淋巴結轉移及宮頸浸潤深度均呈正相關。另 外，WT1-AS、 HOXC-AS3、 AFAP1-AS1、HAND2-AS1等多個lncRNAs 在宮頸癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中均有相關研究報道[14-18]。目前，上述lncRNAs 在EC 中的作用尚未見報道，有待后續進一步探究。

綜上，本研究通過對EC 組織和正常內膜組織的轉錄組進行測序分析其lncRNAs 差異表達譜，結果顯示2 個 組織樣本中lncRNAs 的表達存在顯著差異；進一步的功能分析提示，部分lncRNAs 可能參與EC 的發生及發展過程。由于lncRNAs 具有較高的組織特異性，深入分析這些lncRNAs 或將為EC 的研究及靶向治療提供新思路。

參·考·文·獻

[1] Morice P, Leary A, Creutzberg C, et al. Endometrial cancer[J]. Lancet, 2016, 387(10023): 1094-1108.

[2] Flynn RA, Chang HY. Long noncoding RNAs in cell-fate programming and reprogramming[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(6): 752-761.

[3] Arun G, Diermeier SD, Spector DL. Therapeutic targeting of long non-coding RNAs in cancer[J]. Trends Mol Med, 2018, 24(3): 257-277.

[4] He XY, Bao W, Li XC, et al. The long non-coding RNA HOTAIR is upregulated in endometrial carcinoma and correlates with poor prognosis[J]. Int J Mol Med, 2014, 33(2): 325-332.

[5] Guo QY, Qian ZD, Yan DD, et al. LncRNA-MEG3 inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma by repressing Notch signaling[J]. Biomedecine Pharmacother, 2016, 82: 589-594.

[6] Rinn JL, Chang HY. Genome regulation by long noncoding RNAs[J]. Annu Rev Biochem, 2012, 81: 145-166.

[7] Schmitt AM, Chang HY. Long noncoding RNAs in cancer pathways[J]. Cancer Cell, 2016, 29(4): 452-463.

[8] Chen BJ, Byrne FL, Takenaka K, et al. Transcriptome landscape of long intergenic non-coding RNAs in endometrial cancer[J]. Gynecol Oncol, 2017, 147(3): 654-662.

[9] Li CL, Zheng HS, Hou WL, et al. Long non-coding RNA linc00645 promotes TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition by regulating miR-205-3p-ZEB1 axis in glioma[J]. Cell Death Dis, 2019, 10(10): 717.

[10] Yang XY, Wang CC, Lee WYW, et al. Long non-coding RNA HAND2-AS1 inhibits invasion and metastasis in endometrioid endometrial carcinoma through inactivating neuromedin U[J]. Cancer Lett, 2018, 413: 23-34.

[11] Wang RJ, Li Y, Du PP, et al. Hypomethylation of the lncRNA SOX21-AS1 has clinical prognostic value in cervical cancer[J]. Life Sci, 2019, 233: 116708.

[12] Wei AW, Li LF. Long non-coding RNA SOX21-AS1 sponges miR-145 to promote the tumorigenesis of colorectal cancer by targeting MYO6[J]. Biomedecine Pharmacother, 2017, 96: 953-959.

[13] Lu XY, Huang CJ, He XZ, et al. A novel long non-coding RNA, SOX21-AS1, indicates a poor prognosis and promotes lung adenocarcinoma proliferation[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 42(5): 1857-1869.

[14] Zhang XY, Zhao XL, Li Y, et al. Long noncoding RNA SOX21-AS1 promotes cervical cancer progression by competitively sponging miR-7/VDAC1[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(10): 17494-17504.

[15] Zhang FY, Li JF, Xiao HZ, et al. AFAP1-AS1: a novel oncogenic long noncoding RNA in human cancers[J]. Cell Prolif, 2018, 51(1). DOI: 10.1111/cpr. 12397.

[16] Li XW, Wang Q, Rui YQ, et al. HOXC13-AS promotes breast cancer cell growth through regulating miR-497-5p/PTEN axis[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(12): 22343-22351.

[17] Zhang YX, Na RH, Wang XL. LncRNA WT1-AS up-regulates p53 to inhibit the proliferation of cervical squamous carcinoma cells[J]. BMC Cancer, 2019, 19(1): 1052.

[18] Yang Y, Chen L, Gu J, et al. Recurrently deregulated lncRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Commun, 2017, 8: 14421.