西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16/5- 羥色胺轉運體 通路的影響

錢時興，房 圓，孫 琳，仇 琦，林治光，肖世富，李 霞

上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心老年科，上海 200030

抑郁癥是一種有明顯的復發和慢性化趨向的精神疾病，終生患病率高達15%～20%[1]。在眾多抑郁癥發病的生化機制假說中，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）功能低下是較公認的一種觀點。5-HT 是一種抑制性神經遞質，使交感神經節前纖維興奮及副交感神經節前纖維抑制，參與多種中樞神經活動，如情緒控制、調節睡眠、焦慮、酗酒、攝食、性行為等[1]。在中樞系統，上述調節作用主要由突觸間隙的5-HT 完成。當神經元受到刺激興奮時，細胞內囊泡前移與突觸前膜融合并釋放5-HT 至突觸間隙，作用于突觸后靶細胞受體或突觸前自身受體。5-HT 與受體結合發揮作用后即迅速解離。為防止5-HT 在突觸間隙堆積，其最主要的失活方式是被突觸前膜5-HT 轉運體 （serotonin transporter，SERT）攝取入軸突內并再次進入囊泡儲存。因此，對于突出間隙的5-HT 而言，SERT 是一種關鍵調節蛋白，是5-HT 功能低下假說重要組成部分。目前使用的主流抗抑郁藥物5-HT 再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）也是通過調節SERT進一步調控抑郁癥患者中樞5-HT，從而起到抗抑郁作用。

近年來，在5-HT 功能低下假說基礎上，一些研究進一步探討了微小RNA（microRNA，miRNA）在抑郁癥發病機制中的作用。miRNA 是一類真核生物內源性的非編碼單鏈RNA，能夠通過結合或調節特定mRNA 的蛋白翻譯過程調控基因表達。miRNA 具有很強的細胞、組織及疾病特異性[2]，現有多項抑郁相關的動物實驗研究結果表明miRNA-16 是SSRIs 藥物的治療靶點[3]。SSRIs 類藥物通過miRNA-16 對動物中縫核等腦區SERT 蛋白的翻譯進行調控，進而影響突觸間隙5-HT 濃度，但此結論尚缺乏臨床研究證據。

雖然抑郁癥發病機制涉及抑郁癥患者大腦中樞神經，但miRNA-16 / SERT 通路相關指標在外周血漿及血小板中均存在，為臨床研究抑郁癥的發病機制提供了可能。自發現外周血血小板和中樞系統的5-HT 能神經元都可以釋放5-HT，有相同的囊胞單氨轉運體和5-HT 受體，編碼SERT 的基因也相同后，臨床研究中反映人類中樞系統5-HT 功能的外周血指標多用血小板5-HT 相關指標取代，如血小板內5-HT 遞質及血小板膜SERT 蛋白。

本研究擬通過檢測服用（艾司）西酞普蘭的抑郁癥患者與未用藥患者的外周血miRNA-16 表達水平及血小板膜SERT 蛋白水平，探討西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16/SERT 通路相關指標的影響，希冀為進一步探討抑郁癥的病因及建立抑郁癥外周血生物標志物提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

抑郁癥病例均來源于2012 年3—10 月就診于上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心心理咨詢門診的患者，健康對照者來源于附屬精神衛生中心的工作人員。

未服藥病例組入組標準：①符合《美國精神疾病診斷與統計手冊（第四版）》［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（Fourth Edition），DSM- Ⅳ］修訂版中抑郁癥診斷標準，目前處于發作期的30 d 內且未服藥。② 年齡18 ～65 歲，男女不限。③篩查和基線的漢密爾頓抑郁量表17 項（Hamilton Depression Scale-17 items，HAMD-17）評分＞17 分。④患者本人簽署知情同意書。

藥物治療組入組標準：①抑郁發作期符合DSM- Ⅳ修訂版抑郁癥診斷標準。② 單藥服用（艾司）西酞普蘭治療 6 周及以上。③西酞普蘭治療或維持劑量10 ～40 mg，每日1 次（艾司西酞普蘭5 ～20 mg，每日1 次），規律服藥。④ 年齡18 ～65 歲，男女不限。⑤患者本人簽署知情同意書。

健康對照組入組標準：①年齡18 ～65 歲，男女不限。②無抑郁癥病史或其他精神疾病史。③本人簽署知情同意書。④30 d 內無用藥史。⑤抽血前3 d 未服用動物血液、內臟以及牛蛙、海蜇、菠蘿、香蕉、咖啡、奶酪等影響外周血5-HT 水平的食物。

1.2 隨訪研究流程

在首診完成后對抑郁癥患者的處方進行查詢。未服藥的抑郁癥患者45 例中，有14 例醫師處方予以（艾司）西酞普蘭治療，其余31 例分別被醫師處方予以氟西汀 （4 例）、帕羅西汀（1 例）、舍曲林（12 例）、文拉法辛（6 例）和其他藥物（8 例）治療。與被醫師處方予以（艾司）西酞普蘭的14 例患者保持約2 周一次的電話聯絡進行隨訪，于8 周后進行第2 次隨訪。

1.3 診斷及評估方法

《DSM- Ⅳ -TR 軸Ⅰ障礙定式臨床檢查》（患者版）[4]為定式診斷工具。HAMD-17 是臨床最常用的抑郁障礙評估工具，用于抑郁嚴重程度和療效評估。中文版HAMD-17 的Cronbach's α 系數為0.714，平行效度和結構效度均較理想。共17 個條目，主要采用 0 ～4 分的5 級評分法：0 分為該條目無癥狀，1 分為輕度癥狀，2 分為中度癥狀，3 分為重度癥狀，4 分為極重度癥狀。部分條目為0 ～2 分的 3 級評分法：0 分為該條目無癥狀，1 分為輕至中度癥狀，2 分為重度癥狀。HAMD-17 評分總分＜7 分判斷為無抑郁癥狀，總分＞17 分判斷為存在抑郁癥狀。

1.4 血漿miRNA-16 及血小板SERT 蛋白表達的檢測

熒光定量PCR 檢測血漿miRNA-16 相對表達量。取5 mL EDTA 抗凝外周血，充分搖勻，4 ℃下536×g 離心30 min，將取得的血漿置于-80 ℃冰箱保存備用。按照miRcute miRNA Isolation Kit 說明書從血漿中提取miRNA。依照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 結合頸環引物進行反轉錄，按照TaqMan 通用試劑盒Ⅱ說明書進行熒光定量PCR 反應，通過ABI 7500 型PCR 儀測定CT值，每個反應重復3 次。以5 S RNA 為看家基因，按照2-△△CT方法計算檢測miRNA 的相對表達水平。

Western blotting 檢測血小板中SERT 蛋白水平。主要試劑：一 抗 為Anti-Serotonin Transporter（AB10514P，CBA 公司），按照說明書稀釋；二抗為辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG-HRP（上海西唐公司），工作濃度1:5 000。檢測標本上樣量均為校正后的15 μg 血清蛋白。內參GAPDH 的稀釋終濃度為1:2 000，上樣量為15 μg。根據SERT 蛋白與內參蛋白GAPDH 條帶灰度的比值，計算SERT 蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。采用Kolmogorov- Smirnov 檢驗進行正態分布檢驗，符合正態分布的定量資料以±s 表示；組間樣本的年齡比較采用方差分析，組間性別構成比較采用χ2檢驗。miRNA-16 采用常用對數相關轉換使其符合正態分布，血小板SERT 蛋白相對表達量符合正態分布。對正態分布的資料采用方差分析進行組間比較，組間存在差異采用獨立樣本t 檢驗進行兩兩比較。定性資料以頻數表示。對于14 例未服藥抑郁癥患者進行隨訪，隨訪數據和基線數據的比較采用配對樣本t 檢驗。所有統計檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 組間基本資料比較

未服藥病例組入組47 例患者，其中剔除1 例合并精神發育遲緩患者、1 例原發性血小板減少患者，最后入組45 例；藥物治療組入組33 例患者，其中剔除1 例不規律服藥患者，最后入組32 例（其中服用西酞普蘭19 例，艾司西酞普蘭13 例）；健康對照組匹配性別、年齡、文化程度，招募入組32 例。未服藥病例組、藥物治療組、健康對照組之間性別、年齡的差異無統計學意義，HAMD-17評分差異有統計學意義（P=0.000）（表1）。

表1 3 組一般資料比較Tab 1 Comparison of general data among the three groups

2.2 血漿miRNA-16 及血小板SERT 蛋白表達水平

健康對照組miRNA-16 相對表達量為1.00±1.18，未服藥病例組為0.81±0.85，藥物治療組為1.08±1.78， 3 組間差異無統計學意義（F=0.421，P=0.657）。健康對照組血小板SERT 蛋白的相對表達量為0.96±0.31，未服藥病例組為 0.93±0.35，藥物治療組為0.89±0.35，3 組間差異亦無統計學意義（F=0.112，P=0.894）。

2.3 隨訪研究結果

被隨訪患者與未被隨訪患者的性別、年齡、HAMD-17 評分、服藥前miRNA-16 相對表達量比較，差異均無統計學意義。

未 服 藥 病 例 組 男 性7 例， 女 性7 例， 平 均 年 齡（39.57±14.55）歲。未服藥病例組患者經過2 個月治療，HAMD-17 評分從（21.43±3.37）分降至（10.07±6.91）分，差異有統計學意義（Z=-3.187，P=0.001）；未服藥病例組14 例患者中， 7 例（50%）患者減分率大于50% 。患者服藥前后血小板 SERT蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（t=-0.750，P=0.470）；經過2 個月的（艾司）西酞普蘭治療，患者血漿miRNA-16 相對表達量升高，差異有統計學意義（t=2.455，P=0.032）（表2）。

表2 （艾司）西酞普蘭治療前后抑郁癥患者HAMD-17 評分及血漿miRNA-16 和血小板SERT 蛋白表達水平的比較（N=14）Tab 2 Comparison of HAMD-17 score, plasma miRNA-16 and platelet SERT levels before and after citalopram treatment for patients with depression (N=14)

3 討論

（艾司）西酞普蘭是一種選擇性較高的 SSRIs 類抗抑郁藥物，只對5-HT 系統產生影響，對其他神經遞質系統影響較小，故本研究僅選擇此藥進行“5-HT 功能低下假說”相關通路探討。本研究分為2 個步驟：第一步以未服藥的抑郁癥患者和規律服用（艾司）西酞普蘭6 周及以上患者作為研究對象，探討（艾司）西酞普蘭對抑郁癥患者外周血miRNA-16 / SERT 通路相關指標的影響，結果顯示被試外周血miRNA-16 分布離散度很大，miRNA-16 及其下游調控蛋白SERT 在3 組中無明顯差異；第二步對在第一步中收錄的未服藥抑郁癥患者進行了8 周隨訪，結果顯示在藥物治療后miRNA-16 的表達升高。（艾司）西酞普蘭藥物作用導致此結果的可能性很大，與動物實驗結果有相似性。近年來多項對動物大腦的研究發現miRNA-16 與SSRIs 類抗抑郁劑和SERT 的表達有密切關系。Baudry 等[3]系統論證了在小鼠大腦中miRNA-16 是SERT 轉錄后的阻抑物以及SSRIs類藥物的藥理學靶點，為miRNA 的研究提供新的思路。之后Launay 等[5]在小鼠、海馬中的研究也部分驗證了此觀點。動物實驗研究[6]發現，慢性SSRIs 刺激會提高小鼠大腦中縫核miRNA-16 水平、降低SERT 蛋白水平，在SSRIs 的療效中miRNA-16 起重要作用。總體上，目前的研究結果支持miRNA-16 廣泛參與大腦對SSRIs 的反應，或者說正是SSRIs 導致的miRNA-16 的變化使抗抑郁劑產生了療效。

在本研究的病例對照研究部分，結果顯示與對照組相比，miRNA-16 在未服藥抑郁患者和（艾司）西酞普蘭治療患者血漿中均無變化，與后續隨訪結果不一致。這可能與外周血漿中miRNA-16 的來源有關，因 miRNA-16 非特異性地只在腦部表達[7]，血漿miRNA-16 水平可能會受到外周組織的干擾。一項研究[8]也顯示，未進行藥物干預的抑郁癥患者血漿miRNA-16 水平未發生變化，但腦脊液中miRNA-16 水平顯著降低。

血小板內的5-HT 來源于SERT 的攝入，過程與中樞5-HT 能神經元類似。在中樞系統SERT 能夠清除突觸間隙5-HT，對5-HT 信號的強度和持續性進行微調。既往對血小板5-HT 水平的研究結果比較一致，均觀察到服用SSRIs 后血小板5-HT 顯著降低，而引起這一改變的原因可能與SERT 有密切關系[5]。但是由于技術問題，在臨床實驗中研究人類中樞 SERT 的結合情況和功能存在難度。迄今為止只有正電子成像術可以部分實現對患者中樞SERT 活性的觀察，但也有很大局限性，且在大部分5-HT神經網絡中未發現合適配體[9]。但由于SERT 蛋白在血小板膜中廣泛存在，結構和功能相似，故血小板膜SERT 可能是替代中樞腦組織可以選擇的外周模型。本研究進一步用Western blotting 檢測了血小板SERT 蛋白水平，結果顯示，健康對照組、未服藥病例組和藥物治療組之間SERT蛋白的表達無明顯差異。針對5-HT 與血小板SERT 蛋白密度和表達量關系的相關報道，結論不一致。對血小板功能的體內研究報道，西酞普蘭同時降低了SERT 的功能和蛋白表達[10]。以高血壓患者為樣本的病例對照研究闡述了血漿5-HT 水平與血小板SERT 蛋白水平的關系，認為外源性5-HT 可以改變血小板膜上SERT 分子密度以調控5-HT 的攝取率[11]。Little 等[12]將血小板從血漿中分離，離體狀態下用氟西汀處理并保持其活性，24 h 后檢測血小板SERT 免疫反應性，發現氟西汀處理組血小板SERT 免疫反應性明顯降低。既往研究中也有不支持SERT 蛋白密度或表達量發生改變的結論。Ellis 等[13]對76 篇相關文獻進行了系統分析，認為抑郁癥患者的血小板帕羅西汀結合率與對照組相比無顯著差異。關于SERT 功能降低的形式和原因，Qian 等[14]報道蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可通過參與SERT 的內化，即SERT 從胞膜向胞質轉位，實現其對SERT 的調控。除PKC 外，對SERT 蛋白的研究發現其存在多個蛋白激酶的磷酸化位點。此后的研究證明蛋白激酶、蛋白磷酸酶、活性氧、一氧化氮等信號分子對SERT 有調控作用，彼此之間可能形成復雜的信息網絡相互作用、相互制約，以實現對 SERT 的精細調節[15]。

通過對血小板SERT 的定量檢測，本研究認為在慢性（艾司）西酞普蘭刺激下，血小板5-HT 的減少并非是由血小板膜上SERT 蛋白量或蛋白密度降低這一簡單的變化引起，有可能與SERT 功能降低有關；而抑郁癥患者SERT功能降低的表現形式和原因，仍有待更深入的研究。由于miRNA-16 特異性調節SERT 蛋白的翻譯過程，miRNA-16在血漿中的穩定性可以一定程度上成為血小板膜SERT 蛋白水平未發生改變的原因。

綜上，本研究在抑郁癥患者外周循環中觀察到SSRIs類藥物（艾司）西酞普蘭對血漿miRNA-16 的影響。另外，通過檢測SERT 蛋白水平，排除應用SSRIs 后外周血小板5-HT 水平的降低由血小板膜SERT 蛋白水平降低引起的可能，提示對外周SERT 蛋白的焦點應轉向蛋白功能，為進一步研究提供了方向。本研究也存在以下局限性：①樣本量較小，隨訪研究中僅有14 例服用（艾司）西酞普蘭患者，雖然患者服藥后miRNA-16 變化的一致性較高，但研究結果的證實還需要進一步擴大樣本量以及擴充SSRIs 類藥物使用的種類加以證實。②僅對血小板SERT 蛋白進行了定量檢測，未進一步進行蛋白功能如磷酸化、甲基化等檢測，尚無法明確解釋服用SSRIs 后血小板5-HT 減少原因。

參·考·文·獻

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