基因芯片篩選脂蛋白脂酶基因雜合敲除小鼠的差異表達基因 和通路

陳寧欣，韓亭亭，鄭 爽，劉 偉，胡耀敏

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院內分泌科，上海 200127

隨著社會經濟的發展及人們生活水平的提高，罹患糖尿病的人群數量呈快速攀升的趨勢。2013 年全國流行病學調查結果顯示，我國18 歲及以上人群的糖尿病及糖尿病前期的患病率分別為10.9%和35.7%[1]。糖尿病的發生可增加各類慢性并發癥的風險，不僅會危害人們的生命健康，也給國家帶來了較重的醫療負擔。因此，闡明糖尿病的發病機制對于該疾病的預防和治療具有重大意義。目前，脂毒性在2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發生與發展中扮演重要角色。Banting 科學成就獎獲得者McGarry 教授[2]提出，脂代謝障礙是T2DM的原發病理生理改變，T2DM 糖代謝紊亂的根源即為脂代謝異常，甚至還將T2DM 稱為“糖脂病”。流行病學研究調查結果顯示，高甘油三酯血癥（hypertriglyceridemia，HTG）是T2DM 發病的獨立危險因素[3]。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是催化乳糜微粒（chylomicron，CM）和極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL）中三酰甘油（triacylglycerol，TAG）水解的關鍵酶，其結構和功能的異常可引發HTG[4]。本課題組的前期研究[5-6]發現，Lpl 基因敲除的雜合（Lpl+/-）小鼠可通過HTG 直接誘發糖代謝異常；隨后，進一步研究[7]發現Lpl+/-小鼠出現了胰島脂滴沉積，經胰島β 細胞葡萄糖刺激后，其胰島素分泌能力出現明顯下降。繼而推測，脂毒性可通過引起胰島β 細胞功能障礙來誘發糖代謝異常，但其具體的分子機制尚需進一步探索。

基因芯片具有高通量及高靈敏度的優點，能夠高效率地篩選正常組織和病理組織中差異表達的基因，有助于深入認識疾病發生的分子機制，以達到對疾病的早期診斷及干預。本研究通過基因芯片篩選Lpl+/-小鼠和野生型（wild type，WT）C57BL/6 小鼠的胰島組織中的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并利用生物信息學分析對這些基因進行聚類和功能富集分析，以期為尋找脂毒性介導T2DM 的發病過程中的新的分子機制提供參考和依據。

1 對象和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

40 周齡SPF 級雄性Lpl+/-小鼠及WT C57BL/6 小鼠由北京大學醫學部實驗動物科學部提供[生產許可證號為SCXK（京）2016-2018]，體質量為（25±5） g。所有動物飼養于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院動物房清潔級屏障系統中，使用許可證號為SYXK（滬）2011-2021。小鼠飼以標準飼料，分籠喂養，自由進食和飲水。飼養條件如下：照明周期為12 h/12 h，溫度為21 ℃，濕度為50%～55%。所有動物相關操作均遵循國家及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院有關動物倫理規定及條例。

膠原酶Ⅴ（Sigma，美國），1640 培養基（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），TRIzol 試劑（Invitrogen，美國），反轉錄試劑盒（TaKaRa，日本），SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，日本）。

1.2 研究方法

1.2.1 胰島的分離及純化 麻醉后取小鼠仰臥位固定，顯微鏡下找到小鼠膽總管近肝門處，經膽總管插管逆行注入0 ℃膠原酶Ⅴ消化液。待胰腺緩慢膨脹后，摘除整個胰腺，后經膠原酶Ⅴ消化、密度梯度離心法分離胰島。于顯微鏡下手工挑選完整胰島，加入1640 培養基（含10%胎牛血清），在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h 后更換培養基，用于后續實驗。

1.2.2 微陣列芯片雜交與數據分析 微陣列芯片雜交實驗委托上海慧算生物技術有限公司完成。使用STAR 軟件統計基因的原始序列計數，使用R 語言中DESeq2 篩選Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中DEGs。基因表達的差異用P 值和差異倍數（fold change，FC）的對數（log2FC）表 示。將P＜0.05 且|log2FC|＞2 的 基 因 視 為DEGs。使用R 語言中的clusterProfiler 包對DEGs 進行GO（Gene Ontology） 功 能 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）通路分析，分析結果以P＜0.05 為入選標準。

1.2.3 RNA 抽提及實時熒光定量PCR 檢測 將離體培養的胰島組織收集于離心管中，低速離心獲得沉淀。向其中加入磷酸鹽緩沖液漂洗后，立即加入總RNA 抽提試劑TRIzol，并依照產品說明書操作提取總RNA。而后，采用超微量分光光度計對RNA 濃度進行測定，分裝后凍存于-80 ℃備用。采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）對DEGs 中與胰島β 細胞功能最密切相關的基因進行驗證。根據反轉錄試劑盒說明書，將相關試劑與0.5 μg 總RNA 混合均勻（總體積為10 μL，加入RNA 體積根據濃度計算）進行反應，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。而后使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，將1 μL cDNA 與相關試劑混合配置10 μL反應體系進行qPCR 反應，條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共20 個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）為內參，基因的相對表達量用2-ΔΔCT進行分析。所有數據均進行3 次分析（即設置3 個復孔）。Gremlin 1（Grem1）、骨形態形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，Bmp-2）、Bmp-4 及Gapdh 引物均由上海冠泰生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

Continued Tab

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對研究數據進行統計分析。qPCR 數據用±s 表示，采用t 檢驗進行比較。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選DEGs

本研究采用R 語言中DESeq2 對Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中的DEGs 進行篩選，并采用火山圖和聚類熱圖進行分析。結果顯示共篩選出187 個DEGs，上調基因6 個、下調基因181 個（圖1、2）；其中，表達差異最為顯著的前10 個基因見表2。

圖1 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的火山圖分析Fig 1 Volcano plot of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

圖2 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的聚類熱圖Fig 2 Heat map of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

表2 DEGs 中排名前10 的基因列表Tab 2 Top 10 genes of DEGs

2.2 GO 功能分析

本研究采用R 語言中的clusterProfiler 包進行GO 功能分析，以P＜0.05 進行篩選，結果（圖3）顯示DEGs主要富集在與T 細胞、B 細胞等免疫細胞激活和侵襲以及細胞黏附相關的生物過程，同時與細胞質膜蛋白等細胞組成和細胞因子受體活性調節等生物功能密切相關。

圖3 DEGs 的GO 功能分析Fig 3 GO function analysis of DEGs

2.3 KEGG 通路分析

隨后，本研究使用KEGG 對DEGs 進行通路富集分析，結果（圖4）顯示這些基因主要富集在免疫細胞增殖分化、炎癥信號通路、血管形成和細胞黏附相關通路上，且與Lpl+/-小鼠的胰島β 細胞功能障礙相關。

圖4 DEGs 的KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of DEGs

2.4 關鍵基因的表達驗證

在上述羅列的前10 個DEGs 中，Grem1 編碼的蛋白gremlin 1 為BMP 拮抗劑家族的成員[8]，該蛋白可通過與BMP-2、BMP-4 蛋白的直接結合阻斷BMP 作用的信號通路。研究[9]發現，BMP 可參與胚胎期胰腺生長、增殖及分化的調節，與胰島β 細胞功能有密切關系。基于此，本研究選擇Grem1 進行驗證；結果（圖5）顯示，與WT小鼠相比，Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達量下降了75%，而Bmp-2 及Bmp-4 的表達量則增加了1 倍甚至 更多。

圖5 qPCR 檢測WT 小鼠和Lpl+/-小鼠胰島組織中關鍵基因的表達水平Fig 5 Expression levels of key genes in the islet tissues of WT mice and Lpl+/- mice

3 討論

胰島β 細胞功能異常是導致T2DM 的核心病理生理基礎之一，同時脂代謝紊亂在其發病過程中亦發揮著重要作用。脂毒性是指血中的游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）水平長期較高，而超過了脂肪組織的儲存能力及各組織對FFA 的氧化能力，使得過多的FFA 以TAG 的形式沉積在非脂肪組織，從而造成對該組織的損傷[2]。FFA 的長期作用可誘導β 細胞凋亡、引起β 細胞壞死，以減少β 細胞數目。研究[6]發現，呈現HTG 的Lpl+/-小鼠的脂代謝障礙在發生時間的順序上優先于糖代謝紊亂，可以很好地模擬HTG 引發T2DM 的病理生理過程。本課題組的前期研究[7]表明，Lpl+/-小鼠出現胰島脂滴沉積、胰島β 細胞團體積減小同時細胞凋亡增加，Lpl+/-小鼠胰島細胞經葡萄糖刺激后胰島素的分泌能力明顯下降，而這些結果亦在體外高脂模型（棕櫚酸刺激的胰島β 細胞）中得到了進一步證實。為了探討可能的分子機制，本研究將Lpl+/-小鼠及WT 小鼠的胰島進行分離并純化，利用基因芯片篩選小鼠胰島中的DEGs，并采用生物信息學方法對這些基因進行聚類分析和功能富集，選擇關鍵基因進行表達驗證。

在表達差異最為顯著的前10 個基因中，Ighe、Ighg1、Ighg2b、Igkv9-120 是免疫反應中抗原結合、免疫球蛋白產生及免疫球蛋白受體結合相關的分子；Ifi202b 參與黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎癥體激活的負向調控，且有研究[10]表明該基因還參與了小鼠脂肪干細胞的脂肪生成；有研究者發現，Ubd 在老化和慢性疾病中具有免疫代謝調節作用，還可介導慢性腎臟疾病中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活從而促進腎小管間質炎癥的發生與發展[11-12]；Mmp12 與動脈硬化相關，還可通過調節細胞因子水平來調節小鼠的炎癥反應[13]；Cxcl9 在皮炎的小鼠模型中表達顯著升高，且與炎癥的嚴重程度相關，同時也參與了某些自身免疫疾病的發生[14]；Gimap3 可與核酸及GTP 相結合，與T 細胞發生和存活相關。針對以上基因，目前暫無相關證據表明其與胰島β 細胞功能或T2DM 存在相關性。但值得注意的是，Grem1 編碼合成的gremlin 1 屬于BMP 拮抗劑家族的重要成員，可阻斷下游BMP 信號通路。BMP 是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一員，包括大量保守結構區域的分泌信號分子，可在控制胚胎發育及分化過程中發揮關鍵作用，還參與胚胎期胰腺生長、增殖及分化的調節[9]。有研究[15]表明，促炎細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）可能通過激活BMP-2 誘導胰島β 細胞的凋亡及功能障礙。而BMP-2 和BMP-4 的表達則能夠對胰島β 細胞的增殖及分泌功能產生抑制作用[16]。Sakhneny 等[17]研究發現，胰島β 細胞可表達BMP-4 的受體，且BMP-4 與β 細胞功能相關。上述研究均提示，BMP 信號通路可能在糖尿病胰島功能異常中扮演著重要角色。因此，本研究利用qPCR 對基因芯片的結果進行驗證發現，Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達量較WT 小鼠顯著下降，而Bmp-2 及Bmp-4 的表達量則明顯增加；繼而推測，gremlin 1 及其下游BMPs 信號通路可能參與了由脂毒性介導的胰島β 細胞功能障礙的發生及發展。此外，還有研究[18-19]表明Grem1 可能與T2DM 患者的蛋白尿及糖尿病腎病的發生相關。

通過對DEGs 進行GO 功能分析和KEGG 通路分析，發現DEGs 參與了免疫細胞增殖分化、炎癥信號通路、血管形成和細胞黏附相關通路。已經有研究[20]證實了脂毒性誘導的炎癥反應在胰島功能障礙中的作用，即在高脂喂養的小鼠中，胰島組織中巨噬細胞的浸潤顯著增加；還有研究[21]發現胰島β 細胞內的脂肪細胞可分泌細胞因子及趨化因子，通過激活炎癥信號通路導致β 細胞功能障礙。本課題組最新的研究[7]結果也證實，在Lpl+/-小鼠血清中和棕櫚酸刺激的胰島β 細胞上清液中，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、促炎細胞因子IL-1β、IL-6 及巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）的水平明顯上升，Lpl+/-小鼠胰島組織上清液中MIF 的表達也顯著增加，同時Lpl+/-小鼠胰島組織和棕櫚酸刺激的胰島β 細胞中NF-κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB） /NF-κB 炎 癥 信 號通路被激活，且與β 細胞功能障礙密切相關。而另有研究[22]發現，FFA 可招募外周循環中的炎癥型單核細胞至胰島組織中并轉化為M1 型巨噬細胞，實現對胰島組織中炎癥細胞因子表達的上調，進而導致胰島β 細胞功能 障礙。

本研究GO 功能分析還發現，DEGs 主要富集在T 細胞、B 細胞等免疫細胞激活的生物過程，同時亦有越來越多的研究開始關注自身免疫在糖尿病發病過程中的作用。自身免疫是一種多因素參與的對自身構成成分產生免疫反應的過程，主要特點是自身耐受的缺失以及B 細胞和T細胞慢性的過度反應。研究[23]顯示，T2DM 患者胰島中的促炎細胞因子被激活，可引發免疫反應導致胰島功能異常，這種由炎癥導致的組織損傷會進一步增強自身免疫反應，從而形成惡性循環；且在T2DM 患者的胰島中可觀察到免疫細胞的交替和免疫細胞的浸潤。此外，M1 型巨噬細胞可分泌大量的促炎因子包括IL-12、TNF-α、IL-1、IL-6 等以及趨化因子以參與炎癥反應，進而導致胰島β 細胞功能障礙的發生。而B 細胞與T 細胞的直接作用對胰島β 細胞功能的影響尚缺乏相關證據。因此，更加深入地探索自身免疫在T2DM 發生與發展中的作用和相關機制，或將有助于在臨床上對糖尿病的分型和治療提供參考。

綜上所述，本研究通過基因芯片篩選WT 小鼠及Lpl+/-小鼠的DEGs，并針對這些基因開展相關功能及通路分析，發現DEGs 主要富集于自身免疫和炎癥信號通路，同時脂毒性導致的Grem1 表達下調可能與胰島β 細胞功能障礙的發生密切相關。該結果或將為進一步理解和認識脂毒性導致T2DM 的發病機制提供參考，同時也將為后續的T2DM 病因研究提供新的方向。

參·考·文·獻

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