miR-1225-5p靶向調(diào)控S100A9抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

王華忠，于 江，蘇曉玲，成 薇，陳益國

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二二醫(yī)院檢驗科,湖南衡陽 421001)

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。由于肝癌患者早期無明顯癥狀，多數(shù)患者在確診時已處于晚期[2]。肝癌的治療方法主要有外科手術(shù)、放療和化療、靶向藥物治療等，但術(shù)后易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后較差[3]。肝癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種因素，與多種基因表達失控有關(guān)[4]。從分子水平探討肝癌發(fā)生和發(fā)展機制，對肝癌的靶向分子治療有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)靶向結(jié)合抑制靶mRNA表達或降解mRNA，參與調(diào)控基因的表達，其在細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為中發(fā)揮重要作用[5]。miR-1225-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，有研究顯示，其參與胃癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡等[6-8]，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但目前miR-1225-5p對肝癌細胞生物學行為的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)的3′UTR中含有與miR-1225-5p互補的核苷酸序列，提示S100A9是miR-1225-5p的靶基因。S100A9是鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族成員之一，參與細胞生長、分化、凋亡、炎性反應等生命活動。有研究顯示，S100A9在肝癌患者血清和細胞中表達水平升高，其可促進肝癌細胞的存活和侵襲[9-10]。本研究主要探討miR-1225-5p對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及其是否通過調(diào)控S100A9表達發(fā)揮作用，以期為肝癌的靶向分子治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞和試驗試劑 肝癌細胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3及正常肝細胞系THLE-2(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；四甲基噻唑藍(MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；鼠抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27單克隆抗體(上海長島生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、MMP-14單克隆抗體(北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司)；miR-1225-5p模擬物(mimics)及模擬陰性對照物、miR-1225-5p抑制劑及陰性對照和S100A9過表達載體(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天公司)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 各細胞均用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。當細胞融合度達到80%左右時，吸棄培養(yǎng)基，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組和轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期的Huh7細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，當細胞融合度達到60%時，更換為無FBS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明執(zhí)行，將miR-1225-5p mimics(miR-1225-5p組)、模擬陰性對照物(miR-NC組)、miR-1225-5p抑制劑(anti-miR-1225-5p組)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC組)、S100A9的小干擾RNA(si-S100A9組)、siRNA陰性對照(si-NC組)及miR-1225-5p mimics與S100A9過表達載體(miR-1225-5p+pcDNA-S100A9組)、miR-1225-5p mimics與空載體(miR-1225-5p+pcDNA組)分別轉(zhuǎn)染至Huh7細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)或Western blot試驗分別檢測細胞中miR-1225-5p和S100A9水平并評價轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-1225-5p和S100A9 mRNA表達水平 Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，微量核酸儀測量RNA水平及A260/A280。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR總反應體系為20 μL，擴增條件為95 ℃ 20 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進行35個循環(huán)。miR-1225-5p上游引物5′-GTG GGT ACG GCC CAG TGG GGG G-3′，下游引物5′-CCC CCC ACG GGC CGT ACC CAC-3′；S100A9 上游引物5′-CGG GAT CCA TGG CTG CCA AAA CAG GA-3′，下游引物5′-GCT CTA GAT TAC TTC CCA CAG CCT TT-3′；U6上游引物5′-ACG CAA ATT CGT GAA GCG TT-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；GAPDH上游引物5′-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3′，下游引物5′-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3′。miR-1225-5p以U6作為內(nèi)參，S100A9以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-1225-5p和S100A9 mRNA的相對表達水平。

1.2.4Western blot試驗檢測蛋白表達 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白。以BCA蛋白試劑盒定量后，取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道30 μg蛋白。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶中封閉，時間為2 h。各組分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。再加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG，室溫孵育1 h。最后加入化學發(fā)光試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.5MTT檢測Huh7細胞增殖 轉(zhuǎn)染后的各組Huh7細胞，以每孔1×103個接種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜。結(jié)晶紫充分溶解后，振蕩混合均勻，于酶標儀490 nm處測定A值。

1.2.6Transwell檢測Huh7細胞的遷移和侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的各組Huh7細胞，用不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為每毫升5×104個。細胞遷移試驗：Transwell上室直接加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，計數(shù)。細胞侵襲試驗：將Matrigel基質(zhì)膠用RPMI 1640培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋，鋪于Transwell上室，自然晾干后再加入100 μL細胞懸液，后續(xù)操作步驟與細胞遷移試驗相同。

1.2.7雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-1225-5p與S100A9的靶向關(guān)系 PCR擴增含有miR-1225-5p結(jié)合位點的S100A9的3′UTR序列，并將其插入psi-CHECK載體中，構(gòu)建S100A9野生型質(zhì)粒(S100A9-WT)。同時利用基因定點突變技術(shù)，將結(jié)合位點突變后，插入psi-CHECK載體，構(gòu)建S100A9突變型質(zhì)粒(S100A9-MUT)。分別將S100A9-WT、S100A9-MUT與miR-1225-5p mimics、模擬陰性對照物共轉(zhuǎn)染至Huh7細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞。采用細胞裂解液裂解細胞，取上清液，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測各組的熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-1225-5p和S100A9在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達水平比較 與正常肝細胞THLE-2比較，肝癌細胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3中miR-1225-5p表達水平均降低，S100A9 mRNA和S100A9表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。選擇肝癌細胞系Huh7用于后續(xù)試驗，見圖1。

注：A為miR-1225-5p在肝癌細胞系中的表達；B為S100A9 mRNA在肝癌細胞系中的表達；C和D為S100A9蛋白在肝癌細胞系中的表達。與正常肝細胞THLE-2比較，*P<0.05。

注：A為miR-1225-5p相對表達量；B為miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖的影響；C和D為miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響。與miR-NC組比較，*P<0.05。

2.2miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖的影響 miR-1225-5p組Huh7細胞中miR-1225-5p水平明顯高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明miR-1225-5p mimics轉(zhuǎn)染成功，Huh7細胞中miR-1225-5p過表達。與miR-NC組比較，miR-1225-5p組Huh7細胞培養(yǎng)48、72 h后A值、CyclinD1水平均降低，p21和p27蛋白水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-1225-5p組Huh7細胞遷移和侵襲數(shù)量、MMP-2、MMP-9和MMP-14水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A和B為miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞遷移和侵襲的影響；C和D為miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響。與miR-NC組比較，*P<0.05。

2.4下調(diào)S100A9表達對肝癌Huh7細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-S100A9組Huh7細胞中S100A9水平均明顯低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明S100A9 siRNA轉(zhuǎn)染成功，Huh7細胞中S100A9表達下調(diào)。與si-NC組比較，si-S100A9組Huh7細胞培養(yǎng)48、72 h后A值、遷移和侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP-2和MMP-9水平均降低，p21蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達情況；B為S100A9相對表達量；C為下調(diào)S100A9表達對肝癌Huh7細胞增殖的影響；D為下調(diào)S100A9表達對肝癌Huh7細胞遷移和侵襲的影響；E為下調(diào)S100A9表達對肝癌Huh7細胞增殖相關(guān)蛋白表達水平的影響；F為下調(diào)S100A9表達對肝癌Huh7細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響。與si-NC組比較，*P<0.05。

2.5miR-1225-5p靶向調(diào)控S100A9的表達 生物信息學軟件預測顯示，S100A9的3′UTR中含有與miR-1225-5p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-1225-5p mimics可降低S100A9的3′UTR野生型質(zhì)粒熒光素酶活性(P<0.05)，而對S100A9的3′UTR突變型質(zhì)粒熒光素酶活性物無明顯影響(P>0.05)，說明miR-1225-5p可與S100A9的3′UTR靶向結(jié)合。Western blot試驗檢測結(jié)果顯示，miR-1225-5p組S100A9水平低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，anti-miR-1225-5p組S100A9水平高于anti-miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步說明miR-1225-5p在Huh7細胞中負調(diào)控S100A9的表達。見圖5。

注：A為S100A9的3′UTR中含有與miR-1225-5p互補的核苷酸序列；B為雙熒光素酶報告試驗；C和D為miR-1225-5p對S100A9表達的影響。與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05。

2.6S100A9過表達逆轉(zhuǎn)了miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖、遷移和侵襲作用 與miR-1225-5p+pcDNA組比較，miR-1225-5p+pcDNA-S100A9組Huh7細胞培養(yǎng)48、72 h后A值、遷移和侵襲細胞數(shù)量、CyclinD1、MMP-2和MMP-9水平均升高，p21蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：A為免疫印跡圖；B為S100A9蛋白相對表達量；C和D為S100A9過表達逆轉(zhuǎn)了miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖、遷移和侵襲作用；E和F為S100A9過表達逆轉(zhuǎn)了miR-1225-5p過表達對肝癌Huh7細胞增殖，遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的作用。與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-1225-5p+pcDNA組比較，#P<0.05。

3 討 論

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于真核生物體中，其表達與腫瘤、心腦血管疾病等密切相關(guān)，可作為疾病診斷和治療的靶向指標[11-12]。隨著對miRNA的深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。WANG等[13]研究顯示，miR-1225-5p在甲狀腺癌組織和細胞系中表達下調(diào)，miR-1225-5p過表達可明顯抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進腫瘤細胞凋亡。SUN等[14]研究顯示，miRNA-1225-5p過表達通過靶向下調(diào)細胞分裂周期14B蛋白表達抑制喉癌細胞增殖，阻滯腫瘤細胞周期，并誘導細胞凋亡。目前少見miR-1225-5p影響肝癌細胞生物學行為的相關(guān)報道。

本研究結(jié)果顯示，與正常肝細胞比較，肝癌細胞系中miR-1225-5p表達水平降低，提示miR-1225-5p作為抑癌基因參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)染miR-1225-5p mimics至肝癌Huh7細胞，Huh7細胞的增殖能力降低，遷移和侵襲細胞數(shù)減少，CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平降低，而p21和p27蛋白表達水平升高，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15-16]，說明miR-1225-5p過表達可抑制肝癌細胞Huh7增殖、遷移和侵襲。

miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達，進而影響細胞的生物學行為[16]。為了進一步探討miR-1225-5p抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制，本研究通過生物信息學軟件預測顯示，S100A9的3′UTR中含有與miR-1225-5p互補的核苷酸序列，提示miR-1225-5p可能調(diào)控S100A9表達。進一步通過雙熒光素酶活性檢測和Western blot試驗證實，miR-1225-5p在肝癌Huh7細胞中靶向負調(diào)控S100A9表達。S100A9是一種鈣結(jié)合蛋白，參與下咽癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。HUANG等[20]研究顯示，S100A9在肝細胞癌中表達水平升高，且高表達的患者預后較差，其可作為肝細胞癌早期診斷的生物學標志物。蔡琰[21]研究發(fā)現(xiàn)，S100A9可能通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶通路促進鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，肝癌細胞系中S100A9 mRNA和S100A9表達水平高于正常肝細胞，提示S100A9在肝癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)染S100A9的小干擾RNA抑制S100A9表達后，肝癌細胞Huh7的增殖能力降低，遷移和侵襲細胞數(shù)減少，CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平降低，而p21蛋白表達水平升高，與相關(guān)研究結(jié)果一致[22]，說明下調(diào)S100A9表達可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，過表達S100A9逆轉(zhuǎn)了miR-1225-5p過表達對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示miR-1225-5p通過下調(diào)S100A9表達影響肝癌細胞的生物學行為。

4 結(jié) 論

miR-1225-5p在肝癌細胞系中表達水平降低，過表達miR-1225-5p可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其可能通過靶向下調(diào)S100A9表達發(fā)揮作用，為肝癌的靶向分子治療提供一定的新思路。本研究還存在一定的不足之處，接下來將通過裸鼠移植瘤試驗進一步探討miR-1225-5p對肝癌的影響。