血清谷胱甘肽還原酶活性水平評估乙型肝炎肝損傷患者的臨床價值*

李淑麗，陸善詞，王 軍，楊海輝，何 娟，梁連輝，高文軍

(廣東省中山市第二人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.醫(yī)教科；3.肝病科，廣東中山 528447)

肝臟疾病包括甲型肝炎、乙型肝炎(簡稱乙肝)、丙型肝炎(簡稱丙肝)、肝硬化、脂肪肝、肝癌、酒精肝等多種形式[1]，是一種常見的危害性極大的疾病，肝損傷是這類疾病的主要臨床表現(xiàn)之一[2]。谷胱甘肽是一種細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化劑，在代謝清除親電異源性物質(zhì)的生理活動中起重要作用[3]。谷胱甘肽還原酶(GR)可催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉(zhuǎn)變成還原型谷胱甘肽(GSH)，保持機(jī)體內(nèi)GSH處于高水平，維持體內(nèi)適當(dāng)還原態(tài)環(huán)境[4-7]。有研究表明，在多種肝臟疾病中，尤其是傳染性肝病、急性肝炎的初始階段、肝硬化及涉及肝臟轉(zhuǎn)移的惡性病變中，患者血清GR活性水平均明顯升高[8-9]。此外，在不同臨床環(huán)境中，GR與其他肝源型酶蛋白，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)等，在體內(nèi)的水平有明顯差異。動物模型和臨床試驗(yàn)均證實(shí)，GSH對肝損傷有保護(hù)和修復(fù)作用[10-11]。因此，GR可作為肝損傷程度的評估指標(biāo)，檢測血清中GR活性水平有助于輔助診斷、治療各類肝病，評估肝損傷程度，監(jiān)測治療效果，為現(xiàn)有常規(guī)肝功能檢測指標(biāo)提供補(bǔ)充。本研究以臨床確診的乙肝患者為肝損傷模型，以自建檢測體系調(diào)查血清GR活性水平在表觀健康人群與肝損傷個體中的變化趨勢及其與其他常規(guī)肝功能檢測項(xiàng)目的關(guān)聯(lián)性和差異性，為臨床應(yīng)用GR輔助診斷、治療各類肝病，評估肝損傷程度提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2019年4月在本院確診的606例乙肝患者作為肝損傷組，其中男472例，女134例，年齡18～83歲。另選取同期本院體檢中心表觀健康人群430例作為對照組，其中男205例，女225例，年齡18～83歲。所有研究對象均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1對照組納入標(biāo)準(zhǔn) 所有入選者年齡均大于或等于18歲；肝功能檢測無異常，結(jié)果處于正常參考區(qū)間內(nèi)，ALT：5～40 U/L，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)：0～40 U/L，總膽紅素(TBIL)：1.7～26.0 μmol/L，ALP：40～150 U/L；乙肝5項(xiàng)檢查結(jié)果中乙肝表面抗原(HBsAg)為陰性；丙肝病毒抗體(HCV-IgG)檢測結(jié)果為陰性。

1.2.2肝損傷組納入標(biāo)準(zhǔn) 所有入選者年齡均大于或等于18歲；乙肝5項(xiàng)檢查結(jié)果中HBsAg為陽性，其他4項(xiàng)不作要求。HCV-IgG檢測結(jié)果為陰性。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集所有研究對象空腹靜脈血3 mL，2 h內(nèi)離心并分離血清，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測的標(biāo)本可冷藏(2～8 ℃)保存。24 h內(nèi)無法測定的標(biāo)本需冷凍(-20 ℃或以下)保存，不能反復(fù)凍融，冷凍保存的標(biāo)本最多保存6個月。血清標(biāo)本體積不少于1 mL。

1.3.2生化指標(biāo)檢測 血清GR活性水平采用GSSG底物法檢測，試劑盒由上海潤鴻生物科技有限公司提供，檢測儀器為HITACHI 7180全自動生化分析儀(日本日立公司)。ALT、AST、TBIL和ALP試劑盒由上海執(zhí)誠生化科技有限公司提供，檢測儀器為日立7180全自動生化分析儀(日本日立公司)或SIEMENS ADVIA1800全自動生化分析儀(德國西門子公司)。乙肝5項(xiàng)采用cobas e411全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀(瑞士羅氏公司)及配套試劑檢測。HCV-IgG采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，檢測儀器為BioTek ELX80酶標(biāo)儀(美國寶特公司)。

2 結(jié) 果

2.1對照組與肝損傷組各項(xiàng)生化指標(biāo)測定結(jié)果比較 見表1。對照組和肝損傷組(總體和不同性別分組)研究對象年齡、ALT、AST、TBIL、ALP和GR檢測結(jié)果均呈非正態(tài)分布。對照組與肝損傷組總體比較，肝損傷組研究對象年齡中位數(shù)為38.0歲，高于對照組的35.0歲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝損傷組各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測結(jié)果均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其中肝損傷組總體血清GR活性水平為74.0(62.8～99.0)U/L，明顯高于對照組的52.0(47.0～56.0)U/L(圖1)。對照組男性ALT、AST、TBIL、ALP和GR的檢測結(jié)果與女性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中男性GR活性水平中位數(shù)為53.0 U/L，高于女性的51.0 U/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝損傷組男性僅TBIL和ALP檢測結(jié)果與女性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其他檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 對照組與肝損傷組各項(xiàng)生化指標(biāo)測定結(jié)果比較[M(P25～P75)]

圖1 兩組GR活性水平比較

2.2GR活性水平與其他肝源性生物標(biāo)志物相關(guān)性分析 以1 036例研究對象血清GR活性水平為因變量，年齡、ALT、AST、TBIL和ALP為自變量進(jìn)行多重線性回歸分析，構(gòu)建線性回歸方程為：Y=33.267X+0.306×年齡+0.038×ALT+0.017×AST+0.004×TBIL+0.186×ALP(表2)，相關(guān)系數(shù)r2=0.383。Durbin-Watson檢驗(yàn)值為1.820，說明數(shù)據(jù)間相互獨(dú)立。ANOVA分析模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=127.923，P<0.001)。由表2可見，ALT和ALP的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)分別為0.331和0.319，說明ALT和ALP對GR活性水平的影響最大；年齡和AST對GR活性水平的影響較??；而TBIL的回歸系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.119)，說明TBIL水平對GR的活性水平無影響，二者不相關(guān)。

2.3肝損傷個體中獨(dú)立危險因子的單因素和多因素二分類Logistic回歸分析 以乙肝臨床診斷為因變量，年齡、ALT、AST、TBIL、ALP和GR為自變量進(jìn)行單因素二分類Logistic回歸分析顯示，除年齡外，ALT、AST、TBIL、ALP和GR均為肝損傷的獨(dú)立危險因子。選取除年齡外的其他自變量進(jìn)一步進(jìn)行多因素二分類Logistic回歸分析可見，ALT水平升高，比值比(OR)=1.449，95%置信區(qū)間(CI)：1.306～1.609(P<0.001)；AST水平升高(OR=1.220，95%CI：1.102～1.351，P<0.001)；TBIL水平升高(OR=1.473，95%CI：1.302～1.666，P<0.001)；GR活性水平升高(OR=1.086，95%CI：1.041～1.134，P<0.001)。ALT、AST、TBIL、GR均為由乙肝引起的肝損傷的獨(dú)立危險因子(表3)。

表2 多重線性分析結(jié)果

2.4GR活性水平的ROC曲線分析及比較 對ALT、AST、TBIL、ALP和GR進(jìn)行ROC曲線分析可知，血清GR活性水平對乙肝患者肝損傷的診斷界值為59.5 U/L，AUC為0.899(95%CI:0.881～0.918，P<0.001)，靈敏度為82.7%，特異度為85.3%(圖2)。對不同因子的ROC曲線進(jìn)行比較，ALT和AST的AUC最大，分別為0.984和0.977，診斷效能最大，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TBIL和ALP的AUC分別為0.783和0.818，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。GR與其他因子的AUC比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，診斷效能次于ALT和AST，但優(yōu)于TBIL和ALP(表4)。

表3 單因素和多因素回歸分析

表4 不同因子的AUC比較

圖2 不同因子的ROC曲線

3 討 論

肝臟在有機(jī)體的代謝和排毒過程中起關(guān)鍵作用。藥物、內(nèi)源性或異源性物質(zhì)等多種因素均會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致肝損傷[12]。GSH在肝臟的親電物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中起重要作用，而谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和GR參與調(diào)節(jié)和維持GSH微循環(huán)，清除自由基和過氧化物，抵御各類疾病、內(nèi)源性和外源性侵入[13]。有研究表明，肝損傷患者血清和肝臟中GR活性水平均明顯升高，且上升早于血清ALP，其生理過程可能為：肝損傷時，細(xì)胞膜的滲透能力發(fā)生變化，導(dǎo)致GR隨ALT等其他肝源性酶一同從這些組織內(nèi)釋放至血液中[9]。進(jìn)一步研究確認(rèn)，肝損傷過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致血清中GR活性水平上升[12]。在由四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷動物模型中，氧化應(yīng)激反應(yīng)促使細(xì)胞產(chǎn)生自由基，損害肝臟；而機(jī)體自身的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)被激活以消除自由基帶來的損傷，在該系統(tǒng)中，GPx借助GSH傳遞電子消除有機(jī)物或無機(jī)過氧化物生成GSSG，而GR則將GSSG還原為GSH循環(huán)利用[14]，機(jī)體自身通過增加GPx和GR活性水平改善體內(nèi)的氧化還原環(huán)境，從而消除有害環(huán)境的影響。

本研究結(jié)果顯示：(1)在由乙肝誘導(dǎo)的肝損傷個體中，血清GR活性水平明顯高于表觀健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。按性別統(tǒng)計，肝損傷組男性與女性血清GR活性水平均高于對照組。前期本研究組已報道，在表觀健康人群中，男性血清GR活性水平明顯高于女性，分別為39～72 U/L和41～65 U/L[15]。本研究中肝損傷組男、女性不存在差異，這可能是由于在臨床實(shí)踐中，男性肝炎患者數(shù)量明顯多于女性，導(dǎo)致女性研究對象占比較少(22.1%)，未體現(xiàn)出差異。(2)ALT主要存在于肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)肝損傷時，只要1%的肝細(xì)胞發(fā)生壞死，血清ALT水平急劇升高，是最敏感的肝源性生物標(biāo)志物。ALP主要存在于肝細(xì)胞血竇側(cè)肝竇狀隙表面，在急、慢性肝炎時血清ALP水平呈輕度或中度上升。通過多因素線性回歸分析可知，GR與ALT和ALP的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)分別為0.331和0.319，說明ALT和ALP與GR均呈正相關(guān)，且對GR活性水平影響較大。該研究結(jié)果間接說明，GR與ALT一樣，在肝損傷初期，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時，自肝細(xì)胞釋放至血清中。同時，與ALT和ALP的強(qiáng)相關(guān)性也可說明，血清GR活性水平升高是由肝損傷導(dǎo)致的。GR與AST呈弱相關(guān)(r=0.113)，與TBIL無相關(guān)性，說明GR具有獨(dú)立性，可為現(xiàn)有常規(guī)肝功能檢測指標(biāo)提供補(bǔ)充，且不受年齡影響。(3)二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清ALT、AST和GR活性水平升高在單因素和多因素回歸分析中均是由乙肝引起的肝損傷獨(dú)立危險因子，其中血清GR活性水平每增加1 U/L，肝損傷的風(fēng)險升高1.086倍。而ALP水平升高在多因素回歸分析中不是獨(dú)立的危險因子，這可能是由于ALP的代謝釋放機(jī)制不同，ALP經(jīng)膽管排泄，肝損傷時，肝細(xì)胞對其攝取發(fā)生功能異常，從而使ALP在脂膜上滲透進(jìn)入血液循環(huán)。(4)ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清GR活性水平對乙肝患者肝損傷的診斷界值為59.5 U/L，與近年報道的參考區(qū)間有重疊[15]，在臨床實(shí)踐中應(yīng)結(jié)合其他生物標(biāo)志物綜合考量，并在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化。血清GR活性水平的AUC為0.899，靈敏度為82.7%，特異度為85.3%，診斷效能次于ALT和AST，但優(yōu)于TBIL和ALP。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)，血清GR活性水平升高與乙肝引起的肝損傷明顯相關(guān)，檢測血清GR活性水平可作為輔助診斷、治療各類肝病，評估肝損傷程度的方法。但需要指出的是，本研究僅采用了常見的由乙肝引起的肝損傷個體作為研究對象，未考慮其他肝臟疾病類型，需在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證其臨床價值。