人造血干細胞在不同氧濃度下生長、凋亡狀況觀察研究*

葉 果，楊 鑫

(重慶大學附屬腫瘤醫院頭頸腫瘤中心，重慶 400030)

人造血干細胞(HSCs)在不同因素直接影響下增殖、分化成各種細胞，如骨髓組織細胞、淋巴組織細胞、白細胞、紅細胞、上皮組織細胞等。HSCs具備不停自我更新和變異的潛力。1988年THOMSON等[1]在實驗室成功建立了胚胎干細胞系。從此以后，HSCs在實驗室被進一步培養為多種細胞，包括骨細胞、軟骨細胞[2]、血細胞、神經細胞、肌肉細胞、胰島細胞等[3-4]。基于HSCs優良的不斷增殖和多向分化能力，在組織損傷重建的研究中HSCs表現出突出的作用[5]。與此同時，在臨床修復治療中HSCs的多向分化性也獲得了廣泛應用。在干細胞的培養條件中環境因素至關重要，不同的環境因素包括氧濃度、pH值、溫度、滲透壓等，均能影響干細胞的增殖與分化。氧濃度對干細胞的生長和凋亡有至關重要的影響，JOBIN等[6]的研究發現，在體外培養的低氧環境下，干細胞的生長受到明顯干預。本研究主要觀察HSCs在人體外培養的狀況下，在不同氧濃度中的生長和凋亡情況，為將來的基礎性試驗與臨床應用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1材料 HSCs由上海拜沃生物科技有限公司提供。RPMI1640培養液(上海鈺森生物技術有限公司)、Metho CultTMHCC4230培養基(加拿大Stem cell Technologies Inc公司)、IMDM培養基(上海北諾生物科技有限公司)、二氧化碳培養箱(長沙長錦科技有限公司)、Annextin V(美國Becton,Dickinson and Company)、微氧手套箱(COY Laboratory Products公司)、6孔培養板(廣州潔特生物過濾股份有限公司)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢驗試劑盒(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)、CKC-TR-2W型倒置顯微鏡(Olympus，Japan)、YJ-875型超凈化工作臺(蘇州安泰凈化設備廠)、BD-CAN7型流式細胞儀(美國Becton,Dickinson and Company)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HSCs用10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養。

1.2.2不同氧濃度的細胞培養處置方式 將HSCs分為實驗組和對照組。實驗組細胞在微氧手套箱中培養的氧濃度分別設定為：3%、5%、15%；對照組細胞在微氧手套箱中培養的氧濃度設定為20%。

1.2.3紅系集落形成單位(CFU-E)集落培養 采用Metho CultTMHCC4230培養基，0.9 mL培養基加入0.1 mL的細胞懸液(細胞密度2×109個/升)，用IMDM培養基補足為1 mL，充分混勻后轉移至35 mm的6孔培養板，每份標本重復5孔，置不同氧濃度，37 ℃飽和濕度的培養箱內，培養4、7、10 d時分別計數CFU-E集落數。

1.2.4流式細胞儀檢測HSCs凋亡率 采用10%胎牛血清的RPMI1640培養基，0.9 mL培養基加入0.1 mL的細胞懸液(細胞密度2×109個/升)，用IMDM培養基補足為1 mL，將HSCs在不同氧濃度下分別培養6、12、24 h，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢驗試劑盒，通過BD-CAN7型流式細胞儀檢測HSCs凋亡率。

1.2.5相關性分析 氧濃度為3%、5%、15%、20%分別記作3%氧濃度組、5%氧濃度組、15%氧濃度組、對照組。培養4、7、10 d時研究不同氧濃度和CFU-E集落數的相關性；培養6、12、24 h時研究不同氧濃度和HSCs凋亡率的相關性。

2 結 果

2.1人造血干細胞 倒置顯微鏡下觀察分離培養的人血干細胞，見圖1。

圖1 人造血干細胞(HE×400)

2.2CFU-E集落數結果 培養4、7、10 d，5%氧濃度組CFU-E集落數最高，3%和5%氧濃度組與對照組CFU-E集落數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組CFU-E集落數比較

2.3不同氧濃度組HSCs凋亡率比較 培養6 h，5%氧濃度組HSCs凋亡率最低，3%和5%氧濃度組與對照組HSCs凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；培養12 h，5%氧濃度組HSCs凋亡率最低，5%和15%氧濃度組與對照組HSCs凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；培養24 h，5%氧濃度組HSCs凋亡率最低，3%和5%氧濃度組與對照組HSCs凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞儀測定HSCs凋亡率

2.4不同氧濃度和CFU-E集落數、HSCs凋亡率相關性分析

2.4.1分別培養4、7、10 d，不同氧濃度和CFU-E集落數相關性分析 培養4、7、10 d氧濃度變化與CFU-E集落數均呈正相關(r=0.486、0.848、0.813,P<0.05)。

2.4.2分別培養6、12、24 h，不同氧濃度和HSCs凋亡率相關性分析 培養6、12、24 h后氧濃度變動與HSCs凋亡率均呈正相關(r=0.743、0.785、0.773,P<0.01)。

3 討 論

HSCs在增殖、分化、凋亡過程中受不同環境因素的影響，包括溫度、氧濃度、滲透壓、pH值等，其中至關重要的一項因素就是氧濃度，而最容易忽視的一項因素也是氧濃度。在不同氧濃度下，HSCs的生物學行為顯現出多種多樣。有科學研究推測出HSCs在人體內最適宜生存的微環境不是常氧狀態，而是低氧狀態[7-8]。低氧狀態是人體內普遍存在的一種生理環境，因此，也促進了人體內細胞的發育及多種病變的轉變[9]。目前，國際和國內對于HSCs的體外培養，普遍采用常氧狀態，而體內低氧狀態與實驗室中的常氧狀態有巨大差異，卻較少有研究關注低氧狀態下HSCs的增殖、分化、凋亡情況。因此，本研究選用不同氧濃度培養HSCs，可更為真實地模擬人體內不同的真實生存環境狀態。

HSCs在自我修復、更新及分化方面有明顯優勢。同時，HSCs的增殖、復制、歸巢后重建造血、多向分化、凋亡等生物學方面的功能也受周圍各種環境因素的廣泛制約[10-11]。在人體內骨髓環境中為低氧狀態，而這正是HSCs主要的生存區域[12-13]。人體內的這種低氧狀態，對于HSCs生物學方面的基本功能的持續保持起關鍵作用[14-16]。有研究發現，低氧狀態會促進神經干細胞的增殖，與此同時神經干細胞的凋亡卻出現明顯抑制效果[17]。人體內部的低氧誘導因子(HIF)-1是細胞在低氧狀態下適應與應答調節中的主要轉錄因子，HIF-1在細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生物學活動中起舉足輕重的作用。HIF-1有α和β 2個亞基，常氧狀態下，因為被蛋白酶系統降解的原因，HIF-1α在細胞質內處于失活狀態。而在低氧狀態下，HIF-1α大量聚集活化，同時轉移到細胞核內，與細胞核內的HIF-1β相結合構成HIF-1分子，進而辨識、結合其中包含有低氧化學反應元件的DNA序列，從而介導、調節和管控與低氧反應所涉及基因的表達[18]。在人體內骨髓中平均氧濃度為5%，靜脈血平均氧濃度為12%～15%，動脈血平均氧濃度為20%。本研究將體外培養環境中各組氧濃度分別設定為3%、5%、15%、20%，正是要模擬HSCs在人體內不同氧濃度下的生長、凋亡狀況。而這方面的研究工作國際和國內的報道相對較少。

4 結 論

本研究發現，HSCs分別培養4、7、10 d，其中5%氧濃度組CFU-E集落數最高；分別培養6、12、24 h，其中5%氧濃度組HSCs凋亡率最低。由此推測，不同氧濃度對HSCs的生長和凋亡有直接影響，而其中5%氧濃度能促進HSCs的生長，同時也能抑制HSCs的凋亡，可為今后的臨床應用和實驗室研究提供一定理論依據。