神經外科術后患者手術部位感染肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌分子流行病學研究*

黃澤玉，鄭光輝，呂 虹，康熙雄，張國軍△

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科，北京 100070;2.北京市免疫診斷臨床 工程技術研究中心，北京 100070)

神經外科術后患者手術部位感染是目前困擾臨床的一類重要感染，嚴重影響患者手術的成功率和病死率[1]。有文獻報道，神經外科手術發生術后感染患者的病死率比未發生感染患者提高30%[2]。近年來，隨著臨床上抗菌藥物的大量使用，抗菌藥物耐藥成為一項嚴重的社會問題。由耐藥菌導致的中樞神經系統感染危害更為嚴重，尤其是肺炎克雷伯菌[3]、鮑曼不動桿菌[4]等革蘭陰性菌，由于其易出現誘導耐藥且毒性高，對臨床危害更大。本研究對2014-2019年首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科術后感染患者腦脊液中分離的鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌進行表觀及分子流行病學分析，探究其臨床分離率和耐藥性變化及耐藥基因的分布，為控制神經外科術后患者感染多重耐藥肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2014-2019年首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科術后感染患者腦脊液中分離的肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌進行回顧性分析。本研究執行文獻[5]報道的神經外科術后感染標準：(1)腦脊液細菌培養為肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的患者；(2)腦脊液白細胞計數>250×106/L。同時符合以上2項標準的患者確診為腦膜炎。

1.2藥敏試驗方法 腦脊液標本采用全自動儀器進行培養、鑒定和藥敏試驗，培養系統為Bectec 9240、Bac/alert 800；鑒定藥敏系統包括Phoenix 100、VITEK-2 Compact及VITEK MS等；藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法；結果判斷依據美國臨床和實驗室標準化協會2018年標準[6]。

1.3耐藥基因選擇與檢測 參照文獻[6]選擇30項耐藥基因，采用基于環介導等溫擴增技術(LAMP)建立的恒溫微流控芯片方法對多重耐藥菌進行基因檢測，具體基因參數如下：Ompk35、blaSHV、blaVIM、blaIMP-3、blaKPC、blaTEM、blaIMP-4、blaOXA-1、blaCTX-M-9、blaOXA-66、blaOXA-23、blaCTX-M-1、arr-2、aadA1、CYM-2等，檢測流程圖與示意圖見圖1。

圖1 恒溫微流控芯片方法檢測流程圖與示意圖

1.4統計學處理 采用細菌流行病學監測軟件WHONET5.5和IBMSPSS20.0軟件進行數據分析；計數資料以例數或百分率表示。

2 結 果

2.1神經外科術后患者手術部位感染肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌分布情況 2014-2019年首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科術后共送檢腦脊液標本53 556份，共分離出細菌4 231株，分離率為7.9%，共分屬于2 154例患者，其中革蘭陰性菌885株，分屬于399例患者，構成比為18.5%(399/2 154)。鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌是最主要的細菌，其中鮑曼不動桿菌共102株，占所有革蘭陰性菌感染者的25.6%，肺炎克雷伯菌84株，占所有革蘭陰性菌感染者的21.1%，其次為大腸埃希菌35株，構成比為8.8%，銅綠假單胞菌17株，構成比為4.3%，各年度分離菌株數與構成比見表1。

表1 2014-2019年神經外科術后患者手術部位感染革蘭陰性菌的分離數與構成比分布情況[n(%)]

2.2鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的耐藥性變遷分析 鮑曼不動桿菌對17種抗菌藥物的敏感率見表2。6年間鮑曼不動桿菌的耐藥性逐年上升，其對氨曲南的敏感率在2018-2019年僅為4.9%，整體敏感率為10.3%。美羅培南的敏感率逐年下降，2018-2019年的敏感率降至34.3%，整體敏感率為48.8%。多黏菌素B為最有效的抗鮑曼不動桿菌感染藥物，敏感率為100.0%。除多黏菌素B外，敏感率最高的抗菌藥物為復方磺胺甲噁唑，整體敏感率為55.8%。肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的敏感率見表3，相對于鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯菌的敏感率較高，雖然也出現了逐年下降的趨勢，但其對于氨曲南的敏感率仍為46.9%，對美羅培南的敏感率從2014-2015年的83.9%降至2018-2019年的56.2%，多黏菌素B仍然為抗多重耐藥肺炎克雷伯菌最有效的藥物，敏感率為100.0%，除多黏菌素B外，敏感率最高的抗菌藥物為復方磺胺甲噁唑，整體敏感率為75.5%。

表2 鮑曼不動桿菌對17種抗菌藥物的敏感率比較(%)

表3 肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的敏感率比較(%)

續表3 肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的敏感率比較(%)

2.3神經外科術后感染多重耐藥鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的耐藥基因構成分布 2014-2019年首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科病區術后患者手術部位感染多重耐藥的23株肺炎克雷伯菌和35株鮑曼不動桿菌的耐藥基因測試結果見表4、圖2。35株鮑曼不動桿菌構成比最高的基因型為blaOXA-66[24株(68.6%)]、blaTEM[24株(68.6%)]，blaOXA-23也占了較高的比例[23株(65.7%)]，Ompk35和blaSHV構成相對較低，為40.0%與42.9%。23株多重耐藥肺炎克雷伯菌中，22株(95.7%)由于同時具有Ompk35和blaSHV基因而表現為對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，而產碳青霉烯酶最常見的基因型為blaKPC[19株(82.6%)]，其他類型的碳青霉烯酶相關基因分布較少。

表4 神經外科術后手術部位感染多重耐藥鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的耐藥基因構成分布[n(%)]

注:A為多重耐藥鮑曼不動桿菌；B為多重耐藥肺炎克雷伯菌。

3 討 論

神經外科術后細菌性感染是目前臨床上一類重要的感染，由于神經外科手術的復雜性及患者免疫力相對下降，導致其嚴重影響患者手術的成功率和存活率。本研究結果顯示，神經外科術后感染革蘭陰性菌的構成比為18.5%(399/2 154)。由于分離出的革蘭陽性菌含有大量如凝固酶陰性葡萄球菌的污染菌，導致感染革蘭陰性菌的比例遠遠高于18.5%[7]。除此之外，由于革蘭陰性菌的耐藥性泛濫及侵襲力逐年上升，分析其在神經系統感染方面的流行病學特征有重要臨床意義。鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌是造成神經外科術后細菌性感染構成比最高的革蘭陰性菌，分別占25.6%、21.1%，故本研究對這兩種致病菌進行了表觀及分子流行病學分析，對其耐藥性變遷及耐藥基因的分布進行了分析與檢測。

泛耐藥革蘭陰性桿菌是目前導致臨床上抗菌藥物濫用危機的最主要細菌，2017年2月世界衛生組織公布了12類危險程度最高的耐藥菌名單，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌與碳青霉烯耐藥腸桿菌分列第1位和第3位[8]，均屬于臨床具有極高迫切度的致病菌。鮑曼不動桿菌為神經外科術后分離率最高的革蘭陰性菌，其獲得性耐藥率較高。本研究結果顯示，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的比例較高，達48.8%，且仍存在下降趨勢，2018-2019年其對于美羅培南的敏感率僅為34.3%，對臨床造成極大的威脅。目前，僅多黏菌素B對肺炎克雷伯菌的敏感率達到100.0%，但由于多黏菌素B的低蛋白結合率及高毒性，使其在中樞神經系統感染方面的應用受限。肺炎克雷伯菌是分離率第2的革蘭陰性菌，相對于鮑曼不動桿菌，其毒性與侵襲性更強，感染患者的病死率也高于鮑曼不動桿菌。與鮑曼不動桿菌類似，對肺炎克雷伯菌最有效的抗菌藥物同樣為多黏菌素B，由于多黏菌素的自身因素，導致其在抗中樞神經系統肺炎克雷伯菌感染方面的應用受限。

本研究結果顯示，2014-2019年鮑曼不動桿菌對絕大多數抗菌藥物的耐藥性出現急劇上升，原因可能是抗菌藥物濫用而導致誘導耐藥。由于革蘭陰性菌的大量耐藥基因處于可移動的質粒中，而質粒在各種耐藥菌之間的轉導會導致耐藥基因的水平擴散，造成耐藥菌傳播[9]，故對致病菌的耐藥基因研究可以有效針對耐藥元件的擴散進行控制，進而遏制耐藥菌產生。本研究結果顯示，鮑曼不動桿菌的耐藥基因型主要為D類的blaOXA系列，與文獻[10-11]報道類似。泛耐藥鮑曼不動桿菌的分子流行病學研究顯示，其耐藥基因型主要為blaOXA-23與blaTEM，本研究2項基因型占比分別為65.7%與68.6%,這兩類基因均表達在質粒上，故其存在橫向基因遷移的基礎，若能對耐藥基因的橫向傳播進行阻斷，則可以很好地抑制耐藥元件的傳播。碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的耐藥機制不完全一致，肺炎克雷伯菌的耐藥基因型主要為A類的blaKPC。有文獻報道，亞太地區碳青霉烯耐藥腸桿菌的主要流行株為blaKPC、blaNDM及blaVIM[12-13]，其中blaNDM主要為印度及巴基斯坦流行株[12]。本研究并未出現blaVIM流行株，原因可能為單中心研究。膜孔蛋白Ompk35在肺炎克雷伯菌中表達較高。有文獻報道，膜孔蛋白缺失的革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥性會大幅度上升，故有感染膜孔蛋白缺失的肺炎克雷伯菌時應注意[13]。

4 結 論

綜上所示，鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌是導致神經外科術后手術部位感染的重要細菌，尤其是多重耐藥菌感染更是一項社會問題。如何控制耐藥菌及耐藥基因的傳播是今后工作的重點，尤其是對于易誘導耐藥的鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌，控制其可能存在的基因橫向遷移，是解決耐藥菌傳播的重要方案。