外泌體長鏈非編碼RNA：腫瘤分子診斷新型標(biāo)志物*

常文婧 綜述，李 冬，孫祖俊 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065)

外泌體是直徑為50～200 nm，由脂質(zhì)雙層膜包裹的納米級細(xì)胞外囊泡，廣泛存在于血液、尿液、淋巴液、精液、乳汁、唾液等體液中。外泌體可作為載體攜帶蛋白質(zhì)、核酸[DNA、mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)等]和脂類等物質(zhì)，可通過直接的膜融合作用、內(nèi)吞作用、吞噬作用和配體/受體的相互作用將其相關(guān)成分轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[1]。近年來研究表明，lncRNA可被外泌體攜帶，廣泛參與細(xì)胞間物質(zhì)交換與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并穩(wěn)定地存在于體液中，且不受內(nèi)源性RNA酶對其降解的影響[2]。深入分析外泌體lncRNA在腫瘤中的臨床應(yīng)用，將為腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等提供新的生物標(biāo)志物。

1 外泌體lncRNA概述

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，缺乏完整的開放閱讀框，不具有編碼蛋白能力，或編碼功能受限。lncRNA可調(diào)控基因組在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳學(xué)方面的表達(dá)，參與染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活與抑制，基因組印記修飾，核內(nèi)運(yùn)輸，mRNA剪切和降解等調(diào)控過程，并與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療等密切相關(guān)[3]。目前，已有大量研究結(jié)果證明，病理狀態(tài)下，尤其是腫瘤疾病，許多外泌體lncRNA與正常對照樣本中的表達(dá)水平具有明顯差異，這說明外泌體能夠選擇性地包裝、分泌和轉(zhuǎn)移特定lncRNA，并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[2]。外泌體lncRNA研究是腫瘤生物學(xué)的重要部分，可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等環(huán)節(jié)，在藥物抵抗和免疫抑制微環(huán)境等方面也具有重要作用[2]。外泌體lncRNA可來源于腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，通過惡性細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的信號傳遞作用于特定靶細(xì)胞，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移；另外，外泌體lncRNA被證明可調(diào)節(jié)抗原呈遞，影響免疫細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞的凋亡[4]。由于外泌體lncRNA的上述特性，目前普遍認(rèn)為其可作為腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物。

2 外泌體lncRNA的臨床應(yīng)用

目前，臨床上常用的腫瘤生物標(biāo)志物主要是腫瘤抗原和異位激素，雖然傳統(tǒng)生物標(biāo)志物在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用比較廣泛，但其存在諸多不足，包括靈敏度低、特異性差，且同一種生物標(biāo)志物可能預(yù)示多種癌癥風(fēng)險，存在較大的漏診和誤診概率。因此，尋找敏感、特異、無創(chuàng)的腫瘤生物標(biāo)志物，對腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等均具有重要意義。近年來，隨著液體活檢的深入研究，發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA是最有潛力的液體活檢生物標(biāo)志物之一。通過分析癌原性外泌體攜帶的lncRNA，可以直接獲取更多腫瘤學(xué)信息，協(xié)助腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等[5]。

2.1外泌體lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用 神經(jīng)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，研究顯示，外泌體lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷中具有潛在應(yīng)用價值[6-8]。王博等[6]通過對82例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者和80例健康對照者血漿外泌體lncRNA LINC00511的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血漿外泌體中表達(dá)上調(diào)，并與臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中的lncRNA HOTAIR和SBF2-AS1可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[7-8]，見表1。

表1 外泌體lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用

2.2外泌體lncRNA在消化系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用 消化系統(tǒng)腫瘤主要包括胃癌、膽囊癌、肝癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌，其發(fā)病率和病死率均較高。ZHAO等[9]通過檢測126例胃癌患者和120例健康對照者血清外泌體lncRNA HOTTIP的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組表達(dá)水平明顯高于健康對照組，并與腫瘤浸潤和TNM分期顯著相關(guān)，對胃癌的診斷效能明顯高于血清學(xué)標(biāo)志物[癌胚抗原、糖類抗原(CA)19-9和CA72-4]，是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險因子。因此，外泌體lncRNA HOTTIP是胃癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。XU等[10]通過檢測60例肝癌、85例肝硬化、96例慢性乙型肝炎患者和60例健康對照者血清ENSG00000258332.1和LINC00635的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中兩種lncRNAs表達(dá)水平均明顯高于其他組，且與門靜脈栓塞、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和總生存期相關(guān)；通過一項(xiàng)獨(dú)立隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，ENSG00000258332.1、LINC00635與甲胎蛋白聯(lián)合診斷肝癌具有更高的靈敏度與特異度[10]。HU等[11]采用微陣列分析了50例結(jié)直腸癌患者和50例健康對照者血漿外泌體lncRNA表達(dá)譜，并采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測表達(dá)水平，結(jié)果表明，患者血漿中有6種lncRNAs (LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602)的表達(dá)水平較健康個體明顯上調(diào)，可能成為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。GE等[12]通過對膽管癌患者膽汁外泌體lncRNAs測序、GO分析、KEGG pathway和共表達(dá)分析，以及ROC曲線和生存分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，ENST00000588480.1和ENST00000517758.1表達(dá)水平明顯增加，二者具有成為診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價值。任瀟凡等[13]通過檢測66例胰腺癌患者及66例健康對照者血清中外泌體lncRNA CCAT1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該lncRNA在胰腺癌患者外泌體中高表達(dá)，在胰腺癌的早期診斷中比CA19-9具有更高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性，并且與TNM分期和患者生存期有關(guān)，可作為預(yù)測胰腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。綜上所述，外泌體lncRNA在消化系統(tǒng)各類常見腫瘤，如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等腫瘤患者中的表達(dá)水平與正常對照者比較有明顯差異，具有作為疾病診斷、預(yù)后評估等生物標(biāo)志物的潛能，見表2。

表2 外泌體lncRNA在消化系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用

2.3外泌體lncRNA在生殖系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用 近幾年女性生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率急劇上升，并呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅女性的健康。研究表明，外泌體lncRNA可作為卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌的早期診斷和預(yù)后評估標(biāo)志物[40-44]。QIU等[40]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT-1在卵巢癌患者血清外泌體中呈高表達(dá)，且與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，是卵巢癌總生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。TANG等[41]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者血清外泌體中aHIF表達(dá)水平升高，Kaplan-Meier生存分析顯示，血清外泌體aHIF表達(dá)水平較高的患者總體生存率較差。因此，aHIF被認(rèn)為是卵巢癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素。ZHANG等[42]通過定量檢測宮頸癌患者和健康對照者陰道灌洗液中外泌體lncRNAs HOTAIR、MALAT-1和MEG3表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與正常對照者相比，3種lncRNAs富集于宮頸癌患者外泌體中，可作為宮頸癌診斷的生物標(biāo)志物。ZHONG等[43]通過qRT-PCR檢測H19在乳腺癌患者及健康對照者血清外泌體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌患者中表達(dá)水平明顯上調(diào)，患者術(shù)后H19的中位表達(dá)水平明顯低于術(shù)前；此外，外泌體H19表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，是一種新的乳腺癌診斷標(biāo)志物。WANG等[44]的研究表明，血漿外泌體lnc RNA HOTAIR的表達(dá)與腫瘤組織中受體酪氨酸激酶ErbB2的表達(dá)呈正相關(guān)，可為開發(fā)新的液體活檢生物標(biāo)志物和提高乳腺癌靶向治療效果提供分子基礎(chǔ)。見表3。

2.4外泌體lncRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用 泌尿系統(tǒng)腫瘤主要包括前列腺癌、膀胱癌、腎癌、尿路上皮癌、陰莖癌、睪丸癌等。大量研究表明，血液或尿液中外泌體lncRNA是一種便捷、無創(chuàng)的泌尿系統(tǒng)腫瘤早期診斷及預(yù)后評估的新型標(biāo)志物[45-53]。ISIN等[45]通過比較30例前列腺癌患者和49例良性前列腺增生患者尿液外泌體lncRNA-p21和GAS5的表達(dá)水平，觀察到前列腺癌和前列腺增生患者的外泌體lncRNA-p21表達(dá)水平有明顯差異，而GAS5表達(dá)水平無明顯差異，表明外泌體lncRNA-p21可作為評估前列腺癌患者惡性狀態(tài)的標(biāo)志物。研究人員通過RNA測序來鑒定尿路上皮細(xì)胞癌患者尿液中富集的lncRNA，結(jié)果表明，尿液來源的lncRNA可作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[46]。WANG等[46]的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者及膀胱良性疾病患者相比，外泌體lncRNA H19富集于膀胱癌患者血清外泌體中，生存曲線分析顯示，膀胱癌患者血清外泌體H19水平越高，預(yù)后越差，認(rèn)為血清外泌體H19可作為判斷膀胱癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。QU等[47]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ARSR可作為外泌體的一部分被傳遞給舒尼替尼敏感的腎癌細(xì)胞，導(dǎo)致舒尼替尼耐藥，可作為腎癌預(yù)測耐藥的指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。多種lncRNA參與前列腺癌和膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展，并可在尿液和血液中被檢出，可作為診斷、預(yù)后評估和預(yù)測耐藥的標(biāo)志物。見表4。

2.5外泌體lncRNA在呼吸系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用 肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究表明，外泌體lncRNA對肺癌的早期診斷具有重要臨床意義。ZANG等[54]通過qRT-PCR檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織、血清和血清外泌體中UFC1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織、血清、血清外泌體中UFC1表達(dá)水平均上調(diào)，且高水平的UFC1與腫瘤浸潤有關(guān)，認(rèn)為UFC1是診斷NSCLC的潛在標(biāo)志物。TAO等[55]對NSCLC患者和健康對照者的血清外泌體lncRNA進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)SOX2OT、TBILA和AGAP2-AS1表達(dá)水平明顯上調(diào)，其中TBILA和AGAP2-AS1對早期NSCLC患者具有更好的診斷效率，且這兩種外泌體lncRNAs與臨床廣泛應(yīng)用的血清腫瘤生物標(biāo)志物(CA21-1)聯(lián)合使用，能夠進(jìn)一步提高NSCLC患者診斷的準(zhǔn)確性。LI等[56]對64例NSCLC患者和40例健康者進(jìn)行血清外泌體GAS5定量分析，結(jié)果表明，與健康對照組相比，NSCLC患者GAS5表達(dá)水平下調(diào)，此外，其低表達(dá)與腫瘤體積及TNM分期相關(guān)。因此，GAS5可作為NSCLC早期診斷的標(biāo)志物。ZHANG等[57]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體MALAT-1在NSCLC患者中呈高表達(dá)，尤其是外泌體MALAT-1的表達(dá)水平與腫瘤分期和淋巴轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，可作為NSCLC診斷和預(yù)后評估的液體活檢標(biāo)志物。見表5。

表3 外泌體lncRNA在生殖系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用

表4 外泌體lncRNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用

表5 外泌體lncRNA在NSCLC診斷中的應(yīng)用

3 外泌體lncRNA檢測面臨的挑戰(zhàn)

在外泌體lncRNA的研究中，制備高純度外泌體是后續(xù)試驗(yàn)中至關(guān)重要的一步，是試驗(yàn)結(jié)果可靠的基礎(chǔ)。已有多種方法和技術(shù)可用于外泌體的分離、鑒定及l(fā)ncRNA的檢測，但研究人員也面臨一系列重大挑戰(zhàn)。目前，外泌體lncRNA檢測面臨的挑戰(zhàn)主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)雖然現(xiàn)在不斷推出新的外泌體提取試劑盒，操作步驟也越來越簡便、快速，但總體來說獲得的產(chǎn)物純度依然較低，現(xiàn)有的外泌體提取方法仍存在一定的缺陷，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟，造成各實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果差異較大，因此，暫不適合于臨床大規(guī)模開展；(2)qRT-PCR檢測lncRNA應(yīng)用廣泛，為驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)，可定量，操作簡便，成本低廉，但受到低通量的局限性；(3)RNA微陣列芯片檢測lncRNA具有高通量的優(yōu)勢，但成本高、數(shù)據(jù)處理復(fù)雜；(4)RNA測序技術(shù)具有高通量的優(yōu)勢，但不能滿足檢測單個基因的要求，檢測成本較高；(5)lncRNA的內(nèi)參基因不統(tǒng)一，目前無法確定選取何種基因作為內(nèi)參是穩(wěn)定的，以及如何用合適的內(nèi)參基因來計(jì)算循環(huán)lncRNA的表達(dá)。另外，對于外泌體lncRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及機(jī)制研究有待深入探索，選取作為生物標(biāo)志物的外泌體lncRNA應(yīng)具有檢測的高靈敏度和強(qiáng)特異度，在體液中的豐度應(yīng)較高，而目前研究發(fā)現(xiàn)的一些lncRNAs，如H19、HOTAIR、MALAT-1等在多種腫瘤中呈高表達(dá)，其作為診斷標(biāo)志物的特異度有待進(jìn)一步提升，并且還應(yīng)保證lncRNA在外泌體內(nèi)穩(wěn)定存在，必要時還要驗(yàn)證其穩(wěn)定性，滿足臨床檢測的要求。人體腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都能分泌外泌體，但是目前尚無特異性的標(biāo)志物來區(qū)分外泌體的來源，因此，如何避免正常細(xì)胞分泌的外泌體產(chǎn)生的干擾，分離腫瘤特異性外泌體也是面臨的一大挑戰(zhàn)。

4 總結(jié)與展望

病理活檢作為傳統(tǒng)腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)具有一定局限性，活檢取材對患者有創(chuàng)，具有一定的危險性，包括出血、腫瘤播散等，也不利于重復(fù)檢測和縱向監(jiān)測；另外，病理活檢取材范圍局限，只能留取病變部位的一小塊組織，而腫瘤病變具有異質(zhì)性，因此，不利于準(zhǔn)確、全面地掌握疾病信息。近年來，外泌體lncRNA作為一種無創(chuàng)傷、特異和敏感的腫瘤標(biāo)志物越來越受到人們的重視。外泌體lncRNA檢測多采用血清或血漿標(biāo)本進(jìn)行液體活檢，具有無創(chuàng)、可重復(fù)檢測、實(shí)時監(jiān)測等優(yōu)勢，聯(lián)合影像學(xué)資料及傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物檢測，有望實(shí)現(xiàn)對腫瘤的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、預(yù)后判斷和療效評估。目前，外泌體的分離提取、鑒定及l(fā)ncRNA檢測技術(shù)尚需不斷優(yōu)化，建立統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，對推動外泌體檢測在臨床上的應(yīng)用具有重要意義。考慮到外泌體的來源是異質(zhì)性的，分泌到腫瘤中的外泌體具有多種亞型，外泌體亞型及外泌體對lncRNA的選擇性包裝、分泌和轉(zhuǎn)移機(jī)制都需要深入探索，以確保未來臨床應(yīng)用的準(zhǔn)確性。目前，外泌體lncRNA檢測技術(shù)還存在一定的局限性，那么對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)及新技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用就十分有必要。網(wǎng)絡(luò)數(shù)字模型、生物傳感器、人工智能等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，將為外泌體lncRNA檢測技術(shù)帶來一場新的革命。隨著外泌體lncRNA的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究的不斷深入，外泌體lncRNA除了作為疾病早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等生物標(biāo)志物外，還可作為腫瘤的治療靶點(diǎn)，為腫瘤的精準(zhǔn)診療提供一個新的方向。因此，外泌體lncRNA在腫瘤診療領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。