蘆根多糖誘導自噬和凋亡抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖

鄧小娟，敖素華

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院門診部，成都 610072；2.西南醫科大學附屬中醫醫院肺病科，瀘州 646000)

肺癌在我國具有高發病率和高死亡率等特點，這一大難題長期困擾著臨床醫生。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要的類型，約占80%[1]。目前臨床上常用治療方法包括手術、放化療等，但其療效多數仍不盡人意，臨床治療失敗的主要原因為腫瘤的復發與轉移。由于惡性腫瘤的發生發展涉及多因素、多途徑、多環節等過程，目前臨床上使用的單靶點藥物常常不能達到令人滿意的效果。中藥是藥用化合物的天然寶庫，同時也是發現新型活性化合物的重要途徑。許多報道證實，某些中藥成分具有促進細胞凋亡、激活自噬的活性[2-4]。蘆根常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等[5-8]。調查顯示，許多經典名方中均加入以蘆根為原料的中藥治療肺癌，可顯著抑制肺癌發展并改善肺功能[9-13]。其中，蘆根多糖具有多方面藥理活性，如提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[14]。這些研究均提示蘆根多糖可能具有顯著的抗肺癌作用。然而，蘆根多糖是否對NSCLC具有顯著的抑制作用，有待深入研究。因此，本課題以前期研究為基礎，通過體外及體內模型，開展蘆根多糖對NSCLC抑制的作用及機制研究，為中藥蘆根抗肺癌活性的開發應用奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 A549細胞：NSCLC細胞系，來源于CCTCC武漢細胞庫。本實驗室長期傳代保存，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37 ℃、5%CO2及相對濕度95%條件下常規培養。

1.1.2動物 Balb/c裸鼠：無特定病原體(SPF)級，4～6周齡，雄鼠，體質量16～20 g。購自成都達碩實驗動物有限公司。動物生產許可證號：SCXK(川)2013-24。飼養間溫度：25～26 ℃，飼養間濕度：55%～70%，12 h明暗交替，常規全價繁殖期飼料喂養，自由飲水。

1.1.3藥物與試劑 蘆根(四川省中藥飲片有限責任公司，批號：180528)；蘆根多糖：由實驗室前期制備分離，提取率為1.64%，本實驗室4 ℃保存。順鉑(Cis-platinum，DDP)，每瓶0.02 g，批號：1WA2A1311031B。RPIM 1640培養基(Gibco，批號：1848026)；CCK-8細胞活力試劑盒(Dojindo，批號：GB707)；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：C3062M)；磷酸鹽緩沖溶液-PBS粉末(索萊寶生物科技有限公司，批號：P1010)；二甲亞砜(Dimethyl suphoxide，DMSO，Sigma公司，批號：SHBH7843)；Caspase-3抗體(美國abcam生物科技公司，批號：ab69482)；PI 3 Kinase p110α Goat mAb(Cell Signal Technology，批號：4249)；Phospho-PI 3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199)Antibody(Cell Signal Technology，批號：4228)；Akt Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批號：4603)；Phospho-Akt(Ser473)Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批號：4080)；Bcl-2(D 55G 8)Goat mAb(Cell Signal Technology，批號：4223)；β-Actin(13E 5)Goat mAb(Cell Signal Technology，100 μL，批號：4970)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signal Technology，批號：4414)。

1.1.4主要實驗設備 二氧化碳培養箱(Thermo，USA，型號：LS-C 0150)；潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-2FD)；多模式微孔檢測儀(美國Bio-Tek，USA，型號：Cytation3)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon，型號：TS 100)；電子天平(美國OHAUS，型號：AR 2140，感量：0.01 mg)；流式細胞儀(美國BD生物科技公司，型號：FACSVerse)；移液器(德國Eppendorf系列，2.5～1000 μL)；高速離心機(廣州科栢實驗器材有限公司，型號：lwicrfuge16)。

1.2方法

1.2.1工作液配制 蘆根多糖工作液：取40 mg蘆根多糖，加入1 mL PBS中配制濃度為40 mg·mL-1，臨用前用RPMI 1640培養基稀釋至4，2，1，0.5，0.25 mg·mL-1，備用。順鉑工作液配制：取1瓶順鉑，每次給藥前取100 μL加2400 μL生理鹽水至2.5 mL。順鉑溶液配制在通風櫥中進行，配制后密封備用。

1.2.2小鼠A549肺癌移植瘤模型建立 取對數生長期的A549細胞，胰蛋白酶消化及培養基終止消化后離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，調整細胞密度為1×107個·mL-1。將細胞懸液接種于裸鼠右側腋下，每只接種0.1 mL，7 d后瘤體形成，建立NSCLC A549移植瘤模型。A549細胞接種到裸鼠身上13 d后，若小鼠瘤體體積達到90 mm3，則表明A549裸鼠移植瘤模型成功。

1.2.3蘆根多糖對A549細胞及在體肺癌移植瘤的抑制作用 將移植瘤模型小鼠隨機分為3組，即順鉑組(2 mg·kg-1，每2天腹腔注射1次，9次)，蘆根多糖組(100 mg·kg-1，每天灌胃1次，連續給藥18 d)和對照組(與蘆根多糖組等體積的配制的蘆根多糖溶劑，每天灌胃1次，連續給藥18 d)。

密切觀察小鼠造模前后及給藥前后的精神狀態、飲食、體質量變化及死亡情況。分別于首次給藥后第3，6，9，12，15，18天測量腫瘤體積(V=1/2ab2，a表示腫瘤最長半徑，b表示腫瘤最短半徑)，繪制腫瘤瘤體生長曲線圖。末次給藥后24 h處死，解剖取瘤，記錄瘤體質量，剝取腫瘤組織，并將其固定于10%甲醛溶液中，且剪取部分腫瘤組織凍存于液氮中。

計算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率(%)=(對照組腫瘤體積-藥物組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.2.4CCK-8檢測細胞活性 蘆根多糖處理A549細胞48 h后，將處于對數生長期細胞接種在96孔板中，濃度調整為5×104個·mL-1，加細胞懸液每孔100 μL，細胞貼壁后，每孔加CCK-8 10 μL，孵育2 h，450 nm處測吸光度值(A)。根據A值計算抑制率，抑制率(%)=(對照組A-藥物組A)/對照組A×100%。

1.2.5流式檢測細胞凋亡 藥物干預：以細胞密度為每孔4×105個接種于6孔板，每孔900 μL，設置蘆根多糖組、空白對照組，每組三個復孔。48 h后，蘆根多糖組加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，空白對照組加入RPMI 1640培養基100 μL。

流式檢測細胞凋亡：48 h后取出6孔板，棄去全部上清液，使用PBS液，清洗細胞2次。胰酶消化、離心、PBS重懸，調整細胞密度為1×106個·mL-1。按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書要求，取細胞懸液100 μL于EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，用槍頭輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。隨后，將EP管中的全部液體轉移至流式檢測管中，再加入400 μL PBS，混勻，上機檢測。流式細胞結果按照不同象限區分，Q 1區：PI(+)AnnexinV(-)，代表機械性死亡細胞區；Q2區：PI(+)AnnexinV(+)，代表晚期凋亡細胞區；Q3區：PI(-)AnnexinV(+)，代表早期凋亡區；Q4區：PI(-)AnnexinV(-)，代表活細胞區。

1.2.6Western blotting檢測LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，PI3K，p-PI3K，AKT及p-AKT蛋白表達水平 將細胞以密度為每孔4×105個接種于6孔板中，加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，孵育48 h后，提取蛋白，測含量。跑膠、電泳1.5 h、轉膜 2.5 h、封閉1.5 h。一抗 4 ℃過夜，二抗孵育 2 h，顯色，凝膠圖像分析軟件對結果進行灰度分析。

1.2.7免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達 腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定12 h后，常規石蠟包埋切片，3%H2O2清除內源性過氧化酶，并進行熱修復抗原；加入一抗(Bax，1：100；Bcl-2，1：250；Caspase-3，1：25稀釋)，37 ℃ 孵育；加入HRP標記的二抗孵育；DAB 顯色，蘇木精復染；鏡檢。

1.3統計學方法 數據處理采用SPASS 21.0版統計軟件，結果用均數±標準差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD 法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同濃度蘆根多糖對A549細胞活性的影響 根據抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則，抑制率大于30%認為藥物對腫瘤細胞較為敏感。將不同濃度蘆根多糖分別干預A549細胞24，48及72 h后，使用CCK-8試劑盒對細胞活力進行檢測，結果發現蘆根多糖在濃度100 μg·mL-1，干預48及72 h時，對A549細胞的增殖抑制率最佳，大于30%(P<0.05)，見圖1。

①與對照組比較，P<0.05。

2.2蘆根多糖顯著促進A549細胞凋亡 為進一步探討蘆根多糖對A549細胞增殖活性的抑制效應是否與細胞凋亡相關。利用流式細胞技術檢測蘆根多糖干預后的A549細胞凋亡情況，結果發現與對照組比較，蘆根多糖組早期凋亡(Annexin-V+/PI-，Q3象限)和晚期凋亡(Annexin-V+/PI+，Q2象限)細胞的比例明顯升高(P<0.05)，見圖2。提示蘆根多糖具有促進A549細胞凋亡的作用。

2.3蘆根多糖促進A549細胞自噬 為進一步探討蘆根多糖抑制A549細胞增殖是否亦與激活細胞自噬有關，利用western blot對自噬激活關鍵蛋白LC3以及自噬經典信號通路PI3K-AKT相關蛋白進行檢測。LC3蛋白是一種自噬標記物，自噬激活后LC3-Ⅰ會通過酶解一小段多肽轉變成LC 3-Ⅱ，因此LC 3-Ⅱ/Ⅰ比例增加提示自噬激活[15]。結果發現，與對照組比較，蘆根多糖組LC 3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P<0.01)，表明A549細胞自噬被激活；盡管與對照組比較，蘆根多糖干預A549細胞后其AKT、PI3K總蛋白表達無顯著變化(P>0.05)，但p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.01)，結果見圖3。

A.對照組；B.蘆根多糖組；C.A549細胞凋亡率；①與對照組比較，P<0.01。

①與對照組比較，P<0.01。

2.4蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠模型的體內藥效學研究

2.4.1一般性觀察 在小鼠腋下接種A549細胞，接種后7 d時肉眼可見腫瘤，到第13天時腫瘤體積達90 mm3，成功率90.0%。移植瘤模型建立后小鼠精神萎靡，食欲不振，活動減少，體質量下降。

2.4.2蘆根多糖對A549移植瘤小鼠腫瘤體積及質量的影響 移植瘤模型建成后，予以小鼠蘆根多糖治療，觀察其對小鼠腫瘤的影響。與對照組比較，給藥后第9天開始，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)能明顯抑制小鼠腫瘤體積的生長(圖4)，其中順鉑與蘆根多糖組腫瘤生長曲線相似，提示蘆根多糖與順鉑對腫瘤生長具有相似的抑制效果。給藥第18天后，與對照組比較，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)腫瘤質量低于對照組，順鉑和蘆根多糖對小鼠腫瘤的抑制率分別為39.1%，35.9%(表1)。

表1 蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠腫瘤的抑制率

2.4.3蘆根多糖對A549移植瘤小鼠臟器指數的影響 臟器指數是動物臟器的質量與其體質量之比，主要反映藥物對機體的毒性。與對照組比較，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)小鼠的肝臟及脾臟指數無明顯變化(表2)。

①與對照組比較，P<0.01。

表2 蘆根多糖對A549移植瘤小鼠肝臟、脾臟指數的影響

2.5蘆根多糖對A549移植瘤小鼠Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響 利用免疫組化染色檢測蘆根多糖治療后對A549移植瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響，與對照組比較，藥物治療組(順鉑、蘆根多糖)能明顯抑制Bcl-2的表達(P<0.05)；相反，藥物治療組能顯著促進Bax、Caspase-3的表達(P<0.05)，見圖5。

3 討論

近年來研究發現，中醫經典名方對肺癌有一定的抗癌作用，其中蘆根多糖具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多重功效[14]，但其是否亦可抑制NSCLC的增殖仍不清楚。因此，本研究通過動物和離體細胞實驗探討了蘆根多糖對A549細胞及其移植瘤小鼠模型的治療效應。本研究結果發現蘆根多糖可通過促進細胞凋亡和增強細胞自噬進而抑制A549細胞的增殖和小鼠腫瘤的生長。

考慮到A549細胞株來源于臨床患者肺腫瘤組織[16]，較為符合臨床特征，而且曾經廣泛用于治療肺癌藥物開發(如紫杉醇、多烯紫杉醇、貝伐單抗等)，受到行業認可。因此，A549細胞成為肺癌藥物開發過程中的一種經典的篩選模型。為此，本研究利用A549細胞株建立NSCLC的體外、體內模型，用于評價和探究蘆根多糖抑制NSCLC的藥效作用及其分子機制。此外，臨床證據表明順鉑聯合放療對晚期NSCLC具有良好的治療作用[17]，成為化療藥物中鉑類制劑的首選。因此，選擇順鉑作為NSCLC移植瘤模型的陽性對照藥物。

①與對照組比較，P<0.05；②與對照組比較，P< 0.01。

蘆根味甘，性寒，入肺經，善清透肺熱，常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等，在中醫治療肺癌的諸方、民間驗方中均有應用。蘆根中糖類成分的含量較高，約含51%多糖，前期研究表明蘆根多糖具有抗Hela腫瘤細胞及B16細胞活性[18]，提示蘆根多糖可能對肺癌也具有一定的治療作用。鑒于細胞凋亡和自噬在腫瘤細胞增殖中具有重要作用[19]，筆者在明確了蘆根多糖可顯著抑制A549細胞及移植瘤小鼠腫瘤的增殖基礎上，進一步探討了其發揮抑制效應的潛在機制。研究結果發現蘆根多糖可上調A549細胞移植瘤小鼠腫瘤組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達。提示蘆根多糖可能促進A549細胞產生細胞凋亡效應，抑制移植瘤小鼠A549腫瘤組織形成。此外，還發現蘆根多糖干預治療后可顯著增加LC-3Ⅱ/Ⅰ比例，且AKT、PI3K磷酸化水平增加，表明蘆根多糖可激活細胞自噬，抑制A549細胞增殖，進而顯著抑制A549細胞移植瘤小鼠的腫瘤生長。體內實驗發現蘆根多糖對A549細胞移植瘤小鼠肝臟、脾臟功能無明顯影響，表明蘆根多糖具備潛在的抗癌藥物特性。

綜上所述，蘆根多糖可能通過促進腫瘤細胞凋亡和自噬，抑制NSCLC A549細胞增殖，為其作為一種潛在的NSCLC候選治療藥物。