銀杏活腦膠囊高效液相色譜指紋圖譜研究*

覃鴻恩，漆立軍，徐元翠，夏永芳，彭磊，黃華斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院藥劑科，恩施 445000)

銀杏活腦膠囊是根據我院神經內科名老中醫的經驗方自主研制的中藥復方制劑，由銀杏葉提取物、刺五加、制首烏及三七四味中藥組成。具有活血散瘀、益氣健腦、補腎安神、改善腦供血、增強免疫等功能。主要用于神經衰弱、腦動脈硬化、腦震蕩、高血脂等的作用顯著，療效確切，且在我院相關專科使用較廣泛，作為我院產業化拳頭產品之一，給醫院和社會帶來顯著的效益[1-4]。銀杏活腦膠囊主要有效成分有紫丁香苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及大黃素等化學成分，這些主要成分對治療心腦血管疾病有一定的藥理作用[5-8]。目前，該制劑質量控制標準較低，且有關該制劑的質量控制標準及主要成分的基礎研究鮮有報道[9-10]，為了全面控制制劑質量，保證臨床用藥質量及效果，并為以后的深入研究提供參考，本實驗對銀杏活腦膠囊進行高效液相色譜指紋圖譜研究[11]。

1 材料

1.1儀器 Shimadu LC20A高效液相色譜儀(LC-20AD四元泵，SPD-M20A檢測器，SIL-20A進樣器日本島津公司)，YOKO-2X紫外線分析儀(武漢藥科新技術開發公司)，KQ-500VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，CPA225D電子天平(德國賽多利斯，感量為0.01mg)，HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海寶藍實驗儀器制造有限公司)。

1.2試藥 槲皮素對照品(批號：00081-201408，含量：99.1%)，山李酚對照品(批號：110861-201310，含量：93.2%)，異鼠李素對照品(批號：110860-201410，含量：99.9%)，紫丁香苷對照品(批號：111574-200603，含量：96.4%)，大黃素對照品(批號：0922-201506，含量：99%)，蘆丁對照品(批號：1008-201601，含量：98%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb1對照品(批號：160106，含量：98%)，三七皂苷R1對照品(批號：160520，含量：98%)，均購于北京萬佳首化生物科技有限公司；人參皂苷Rg1對照品(批號：15121303，含量：98%，購于河南省標物生物科技有限公司)。

銀杏活腦膠囊(本院制劑室自制，批準文號：鄂藥制字Z20180310，批號：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：25～30 ℃；檢測波長：254 nm；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，見表1所示。

表1 流動相梯度洗脫

2.2供試品的制備 按照處方比例，取刺五加全量，制首烏0.7倍處方量加水煎煮，煎煮兩次，第一次加水10倍量，煎煮2 h，第二次加水8倍量，煎煮1.5 h，合并兩次煎煮液，濾過，濾液濃縮至浸膏(相對密度1.20～1.35)，備用；取剩余制首烏、三七干燥，粉粹成細粉，與銀杏葉提取物混勻，備用；上述浸膏與藥粉混合后制成顆粒，裝入膠囊，即得。同法制得4批銀杏活腦膠囊，即20180801，20180814，20180821，20180825。

分別取以上4批銀杏活腦膠囊內容物約0.5 g置于10 mL量瓶，加入甲醇定容至刻度，超聲提取15 min，濾過，粗濾，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試樣品溶液，每批取3個平行樣品。

2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取紫丁香苷、大黃素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1，分別制成每毫升甲醇中含有以上對照品0.23，0.33，0.28，0.37，0.17，0.49，0.40，0.3，0.22 mg的溶液，冷藏，備用。

2.4混合對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對照品2.88 mg、大黃素對照品3.12 mg、蘆丁對照品1.78 mg、槲皮素對照品3.05 mg、異鼠李素對照品2.38 mg、山奈酚對照品2.42 mg、人參皂苷Rg1對照品3.75 mg、人參皂苷Rb1對照品3.20 mg及三七皂苷R1對照品2.89 mg，混合置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，溶解完全，備用。

2.4方法學考察

2.4.1精密度考察 取“2.2”項下同批次(批號：20180801)銀杏活腦膠囊供試溶液，按照“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次測定，記錄色譜圖。以重復性和分離度均較好的31號峰大黃素為參照峰S，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算二者RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.001%～0.034%，相對峰面積的RSD為0.010%～0.161%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2穩定性考察 取“2.2”項下同批次(批號：20180801)銀杏活腦膠囊供試溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別于制樣后0，2，4，8，12 h，吸取該供試品溶液10 μL，進樣，測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算二者RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.003%～0.050%，相對峰面積的RSD為0.014%～0.108%，表明該方法穩定性良好。

2.4.3重復性考察 取銀杏活腦膠囊(批號：2018105)樣品，按照“2.2”項下方法制備6份供試品，并依據“2.1”項下色譜條件進樣，測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD，結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.004%～0.026%，相對峰面積的RSD為0.019%～0.133%，表明該方法重復性良好。

2.5指紋圖譜的建立及主要色譜峰的化學指認 取6批銀杏活腦膠囊樣品(批號：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)，分別按照“2.2”項下方法制備，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣，得到銀杏活腦膠囊的HPLC指紋圖譜，根據相對保留時間和相對峰面積的比對，標記共有峰為33個，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD，結果見表2和表3。在相同的色譜條件下，測定對照品和混合對照品的特征指紋圖譜，并與銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜進行比對分析，最終確定9個特征共有峰的歸屬，見圖1。

表2 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相對保留時間結果

表3 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相對峰面積結果

2.6銀杏活腦膠囊HPLC指紋圖譜相似度評價 將“2.5”項下的6批銀杏活腦膠囊樣品的指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012 A版)進行相似度評價分析[12]，色譜峰自動匹配后，生成對照指紋圖譜，見圖2。以樣品4作為對照指紋圖譜，以其他樣品指紋圖譜作為對比，進行匹配，采用平均值法得到對照HPLC指紋圖譜，通過匹配分析后得到33個共有峰，即為銀杏活腦膠囊的共有指紋峰，并以31號特征峰(化學指認為大黃素)作為參照，設其保留時間和峰面積均為1，自動匹配，計算得到6批銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度，其結果依次為0.897，0.894，0.933，0.925，0.916，0.940。6批不同批次銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜相似度均在0.894～0.940之間，說明銀杏活腦膠囊各批次之間相似度較好，質量穩定性較好。結果見表4。

表4 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相似度結果

S1.供試品；S2.混合對照品；1.紫丁香苷；2.蘆丁；3.槲皮素；4.山奈酚；5.異鼠李素；6.人參皂苷Rb1；7.人參皂苷Rg1；8.三七皂苷R1；9.大黃素。

圖2 6批銀杏活腦膠囊供試品指紋圖譜及對照圖譜

3 討論

3.1供試品的制備 一方面，為了保證臨床療效，方中重要藥材三七、銀杏葉提取物及0.3倍處方量的制首烏均以原粉入藥，其余用水煎煮，通過提取工藝優化后，確定以兩次水煎煮最佳；另一方面，因該方已經被申報為院內制劑，正在被批量生產用于臨床，實驗工藝應與生產工藝同步，從而降低制劑與實驗樣品的質量差異，使本次研究結果更能直觀地反映制劑質量。在制備樣品溶液時，考察了1%，2%，3%，5%，6%，8%的不同濃度，考察了甲醇、水、乙醇等不同溶劑，同時考察了不同提取方法，綜合考慮，最終確定最佳方法為濃度為5%，甲醇作為溶劑，超聲15 min。

3.2流動相的選擇 本次研究考察的流動相有甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈-水作為流動相時，峰型尖細修長，但是由于乙腈洗脫能力強，導致峰聚集，分離度較差，不利于相似度的分析；甲醇-水作為流動相時，峰型較差，時有肩峰出現，洗脫效果稍差；甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時，峰型最佳，肩峰較少，分離度較好。故最終確定以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫作為本次指紋圖譜研究的最佳流動相系統。同時，考察了0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL·min-1的流速條件，最終確定以流速為1.0 mL·min-1最為合適。由于成分較復雜，所產生的峰較多，故采用0～120 min內梯度洗脫，各峰分離效果較好，分布較均勻。

3.3波長的選擇 通過查閱文獻[13-17]，并且通過實驗，表明紫丁香苷的最大吸收波長是265 nm，大黃素的最大吸收波長為254 nm，蘆丁在257 nm處有最大吸收，槲皮素、山奈酚和異鼠李素的最佳吸收波長是360 nm，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的最佳吸收波長是203 nm。本實驗采用全波長掃描，通過3D色譜工作站進行分析，初步判斷吸收較好的波長范圍在230～275 nm之間。選擇230，254，275 nm再進一步進行分析比較，當波長為230 nm時，色譜圖中峰較少，分布不均勻，有部分拖尾峰出現；當波長為275 nm時，色譜圖出峰較晚，峰形差，雜質峰較多，分離度差；當檢測波長為254 nm時，色譜峰分離較好，峰形較好，且能夠較多的檢測到峰，因此確定以254 nm作為最佳檢測波長。

3.4進樣量和柱溫的考察 分別考察了2，4，6，8，10，12 μL的進樣量，比較各進樣量下的色譜圖，進樣量為10 μL的色譜峰，比較穩定，雜質峰較少，因此采用的進樣量為10 μL；同時，考察了色譜柱溫度對色譜峰的影響，當柱溫在25～30 ℃范圍內，色譜峰峰形較好，穩定性較好，故將柱溫確定在25～30 ℃之間為最佳。

3.5色譜峰的歸屬及相似度分析 本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”將銀杏活腦膠囊的供試品HPLC圖譜與混合對照品HPLC圖譜進行比較，初步確認出9個峰的化學歸屬，并將這9個峰進行藥材歸屬分析，其中，1號峰紫丁香苷主要來自刺五加，2號峰蘆丁、3號峰槲皮素、4號峰山奈酚和5號峰異鼠李素主要來自銀杏葉提取物，6號峰人參皂苷Rb1，7號峰人參皂苷Rg1，8號峰三七皂苷R1主要在三七藥材中顯著突出，9號峰大黃素來自于制何首烏。所建立的HPLC指紋圖譜，通過確認和分析，產生共有峰33個，說明不同批次有較多的相近的組成成分，可以說明該生產工藝和制備方法具有較高的穩定性和成分保留率高。在對6個不同批次的指紋圖譜進行相似度分析時發現，有兩批樣品的相似度稍低(<0.900)，其他4批樣品的相似度均高于0.900，說明該產品的質量比較穩定，差異較小，質量一致性好。

綜上所述，該指紋圖譜能夠表達出銀杏活腦膠囊的所有原藥材的主要成分，而這些主要成分也是銀杏活腦膠囊發揮藥效的關鍵，因此通過本次研究得到的銀杏活腦膠囊HPLC指紋圖譜，可作為銀杏活腦膠囊質量控制的指標之一。本次HPLC指紋圖譜的研究也為未來銀杏活腦膠囊的進一步研究提供基礎，有助于推動銀杏活腦膠囊的臨床評價研究，促使該藥品得到更廣泛的應用。