脂肪氧化酶對玉米種子有關特性的影響

沈慶榮

摘 要：以玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565為材料，對自然越夏條件下玉米種子有關特性進行研究。結果表明：（1）根據Lox-1、Lox-2同時缺失的材料較耐儲藏的研究結果，玉米親本565屬不耐儲藏材料，親本409、410及其雜種后代409×565和410×565屬相對較耐儲藏材料;（2）玉米雜種后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，控制玉米耐儲藏的脂肪氧化酶缺失為隱性遺傳;（3）耐儲藏材料（親本409、410、雜種后代409×565和410×565）的發芽率和淀粉酶活性均顯著高于不耐儲藏親本565高出很多，而MDA含量和脫氫酶活性則表現相反。

關鍵詞：玉米;脂肪氧化酶;種子性狀;影響

中圖分類號 S513;O629.8文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）14-0028-03

作物種子是人類繁衍、生存和發展最根本的物質基礎。種子的妥善保存為我國作物育種、生物工程及21世紀實現農業可持續發展提供了重要的物質保障[1]。玉米作為我國主要糧食作物，種植面積大，產量接近我國糧食總產量的1/3。但是玉米耐儲藏性差，一旦儲藏條件不適宜，極易陳化。種子陳化變質的機理眾說紛呈，其中脂質過氧化被公認為是導致種子陳化變質的最主要因素，而脂肪氧化酶是脂質降解的關鍵酶[2]。

脂肪氧化酶是一種含非血紅素鐵的蛋白質[3]，專一催化具有順順—戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應，氧化生成共軛雙鍵的氫過氧化物，其反應底物主要有亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等游離多元不飽和脂肪酸。脂肪氧化酶的同功酶主要有3種，分別為Lox-1、Lox-2、Lox-3，目前在水稻上存在并且在水稻耐儲藏性、抗蟲性等方面的作用均已得到了驗證[2-4]。脂肪氧化酶的缺失可以中斷脂質的氧化反應，減輕谷物的氧化變質，使谷物儲藏不會因陳化變質作用而降低品質，保持谷物的清新氣味。而玉米的脂肪含量通常在4%左右，極易酸敗變質或遭病蟲侵害，每年因陳化變質造成的損失高達數百億元。脂質的降解是導致谷物儲藏期間品質變劣、產生陳味的根源。筆者以玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565為材料，在自然越夏條件下對玉米種子的特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗材料由安徽科技學院玉米研究所提供，分別為玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 在自然條件下將玉米種子越夏儲藏，試驗時間設定在2018年10月。

1.2.2 脂肪氧化酶缺失測定 玉米取胚1粒（單粒測定），加入檢測液2mL研磨，然后4000r/min離心10min，取上清液1mL倒入比色管，加入指示液3mL，放置4～30h（不同的同工酶顯色時間不一致）后比色（對照上清液80℃水浴30min）。

1.2.3 不同老化處理時間發芽指標的測定 按照GB/T3543.4—1995技術規定[4]進行發芽實驗，測定發芽率。選取直徑1mm的沙礫作發芽床。將沙清洗消毒，取直徑150mm的培養皿作發芽容器。先在培養皿中鋪0.5cm厚沙，每個培養皿播50粒種子并覆1.5cm厚沙。沙子含水量在60%～80%（即100g干沙中加8～26mL水）。加蓋培養皿蓋，3次重復，然后置于發芽室中弱光條件下25℃、相對濕度80%恒溫恒濕培養。當幼苗長至1cm左右時取下培養皿蓋，然后每天定時用噴霧器補水1次，保持苗床含水量在60%～80%。

1.2.4 淀粉酶活性測定 根據《植物生理生化實驗原理和技術》（王學奎主編，第2版）中的淀粉酶活性測定方法[5]進行測定計算，在540nm波長下比色，按式（1）計算：

式中：X為表上查得的麥芽糖含量（mg），VT為淀粉酶原液總體積（mL），VS為測定時取得酶液體積，W為樣品質量，t為反應時間（min），N為樣品稀釋倍數。

1.2.5 丙二醛（MDA）含量測定 稱取0.5g玉米葉，加5%三氯乙酸（TCA）5mL，研磨后所得勻漿在3000r/min離心10min。取上清液2mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2mL，混合后在100℃水浴30min，冷卻后再離心1次。分別測定上清液在450、532和600nm處的吸光度值，并按式（2）算出MDA濃度C（μmol/L），參照文獻[6]方法測定。

式中：C為丙二醛的濃度，A450、A532、A600分別代表450、532和600nm波長下的吸光度值。

1.2.6 脫氫酶活性測定 參照胡晉（1986）TTC改進法[7]，將老化玉米種子萌發1d，剝下胚，每個樣品10個完整胚，加入新鮮0.1% TTC溶液10mL搖勻，蓋上塞子，置35℃溫箱（黑暗）中染色3h，終止反應后蒸餾水沖洗3次，取出濾干后移入試管中，加入10mL 95%酒精于35℃溫箱中浸提24h。測定490nm下的OD值

2 結果與分析

2.1 不同玉米親本材料的耐儲藏性 玉米中含有多種酶，其中脂肪氧化酶主要催化不飽和脂肪酸中含雙順式1，4—戊二烯結構。通過加入分子氧，生成各種過氧化物，直接影響玉米種子質量。前期研究表明：Lox-1，Lox-2同時缺失時材料較耐儲藏，否則不耐儲藏;Lox-3影響蟲蝕率。由表1可以看出，親本565的Lox-1、Lox-2表現不缺失，Lox-3表現缺失，可以判定屬不耐儲藏材料;親本409和410表現一致，Lox-1、Lox-2同時缺失，Lox-3不缺失，屬耐儲藏品種。

2.2 不同玉米雜種后代脂肪氧化酶的遺傳規律 脂肪氧化酶存在于多種禾本科植物中，其中自花授粉作物大豆、水稻脂肪氧化酶含有3種（Lox-1、Lox-2、Lox-3），分別由1對基因控制。3種同工酶存在分別由單個顯性基因控制，而3種同工酶缺失分別由3個隱性等位基因控制[8]。由表2可以看出，脂肪氧化酶缺失試驗測定結果顯示，雜種后代409×565和410×565的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，這可能是由于試驗測定的群體較小以及玉米是異花授粉作物所造成的;其不同位點的缺失與否，是在不同波長的OD值與其對照相比較得出的（其中Lox-1、Lox-2是在432nm下比較得出的，Lox-3是在534nm下比較得出的）。由此可見，玉米脂肪氧化酶缺失屬于一種隱性遺傳。

2.3 不同玉米親本及雜種后代的生化指標

2.3.1 發芽率 玉米在儲藏過程中，內部會發生各種生理生化反應，進而影響其發芽率。發芽率的變化也反映了玉米在儲藏過程中對逆境的抵抗能力，進一步反映了玉米能否耐儲藏的生理特性。由表3可以看出，經過自然越夏儲藏后，玉米親本409、410、雜種后代409×565和410×565的發芽率高達78.3%、80.2%、77.2%和79.4%，不耐儲藏的親本565只有71.8%。耐儲藏材料發芽率明顯高于不耐儲藏材料，結合2.2研究結果可以判斷雜種后代409×565和410×565的儲藏特性屬較耐儲藏。

2.3.2 淀粉酶活性 淀粉酶能夠產生還原性糖，淀粉酶活性的大小與產生的還原糖量成正比，可用麥芽糖作標準曲線，用比色法測定淀粉酶生成的還原糖量，以單位質量的樣品在一定時間內生成的還原糖量表示酶活力[5]。玉米種子的淀粉酶活力決定了種子活力，進而決定其耐儲藏特性。由表3可知，經過自然越夏儲藏后，玉米親本409、410、雜種后代409×565和410×565的淀粉酶活性要比親本565高得多，耐儲藏材料的淀粉酶活性約為不耐儲藏材料的5～6倍。

2.3.3 丙二醛含量 玉米種子在儲藏過程中，膜質由于過氧化作用會導致其完整性遭到破壞[9]，導致電解質外滲。通過測定MDA含量可以衡量膜質過氧化水平。由表3可知，相對不耐儲藏的親本565而言，耐儲藏的親本材料409、410及雜種后代409×565和410×565的MDA含量很少，約為親本565的1/3～1/2。由此可知，經過自然越夏后，耐儲藏材料的膜質破壞程度較小，細胞物質外滲較少，膜受到的傷害較輕。

2.3.4 脫氫酶活性 脫氫酶活性是測定種子活力的重要指標，脫氫酶能準確快速地反映種子胚細胞的還原能力。氧化態的氯化三苯基四氮唑（TTC）接受了活種子呼吸過程中脫氫酶產生的氫，變成還原態的紅色三苯基甲臜（TTC）。提取后定量測定，TTC含量愈高，脫氫酶活性愈強，種子活力愈高[9]。玉米種子是典型的淀粉性種子，活力很高，脫氫酶活性也很高。由表3可知，不耐儲藏的材料親本565的脫氫酶活性要比其他2份自交系和2份雜交種高出0.254～0.272個單位。種子活力的高低直接決定了儲藏過程中的生理變化，活力越高則儲藏越困難。由此可知，雜種后代409×565、410×565的儲藏安全性相對較高。

3 結論與討論

種子在儲藏過程中會逐漸老化并最終喪失發芽能力，種子陳化是自然界的普遍現象，也是農業生產中的嚴重問題。本研究發現，Lox-1、Lox-2同時缺失的材料在儲藏過程中具有較好的抗逆性，相對較耐儲藏;耐儲藏的親本409、410、雜種后代409×565和410×565的發芽率和淀粉酶活性顯著高于不耐儲藏親本565，而MDA含量和脫氫酶活性則表現相反;玉米雜種后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，屬隱性遺傳，這與自花授粉作物水稻、大豆的研究結論相一致。但是玉米作為異花授粉作物，其種子基因純合具有一定難度，而且品種間也存在較大差異，難以找到高度純合的材料。前期研究結果也表明，不同的參試品種或品系種子存在較大差異，主要可能與玉米種子的純合度有關。

參考文獻

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[2]Wilson D O，McDonald M B.Tlipid eroxidation model of seed deterioration[J].Seed Science and Technology， 1986（14）：259-268.

[3]Loiseau J，Vu B L，Macherel M H，et al.Seed lipoxygenases：occurrence and functions[J].Seed Science Research， 2001（11）：199-211.

[4]畢辛華，戴心維.種子學[M].北京：中國農業出版社，2002：49，81-82，88.

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[6]李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，1999.

[7]Hu J . Improvement of seed activity measurement-TTC quantitative method[J].Seed，1986（5-6）：71-72.

[8]吳躍進，吳敬德，張瑛，等.一種作物脂肪氧化酶同工酶快速檢測技術[P].中華人民共和國知識產權（發明專利公報），2001，17（21）：53.

[9]Bewly，J. D. Black. M. Seeds. Physiology of Development Germinition[M]. New York，U.S.A.，1985.

（責編：徐世紅）