IgA腎病患者尿外泌體、腎臟組織中BAFF表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系

曹英杰，陳曉嵐，郭乃鳳，陳旭，劉靜

南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001

目前，我國(guó)IgA腎病占全部原發(fā)性腎小球疾病的30%～40%[1]。研究已一致認(rèn)為IgA腎病是進(jìn)展性疾病，診斷后每10年約有20%的患者進(jìn)展到慢性腎功能衰竭[2]，早期診斷及監(jiān)測(cè)十分重要。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者體內(nèi)存在B細(xì)胞異常活化，其血液中B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)水平明顯升高[3,4]。BAFF是腫瘤壞死因子超家族成員之一，與B淋巴細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合后誘導(dǎo)后者增生、分化并分泌免疫球蛋白，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用。BAFF表達(dá)異常可導(dǎo)致機(jī)體自身免疫失衡，進(jìn)一步誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生[5]。有研究報(bào)道，給予BAFF抗體治療后，IgA腎病小鼠的蛋白尿明顯改善[6]。目前對(duì)于尿液中BAFF含量的研究較少，尤其是尿外泌體相關(guān)研究，尚未見報(bào)道。尿液外泌體中的蛋白來源于腎小球、腎小管及膀胱細(xì)胞等，可作為腎臟疾病的生物學(xué)標(biāo)志物。Pisitkun等[7]第一次用超速離心法在尿液中獲得了外泌體，并且在外泌體中鑒定出疾病相關(guān)蛋白。此后有學(xué)者發(fā)現(xiàn),早期胃癌與晚期胃癌患者尿外泌體中尿激肽釋放酶10水平存在明顯差異[8]。本研究觀察了IgA腎病患者尿外泌體、腎臟組織中BAFF的表達(dá)變化，分析其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，為IgA腎病的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2018年12月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎穿刺活檢病理檢查確診為原發(fā)性IgA腎病的患者60例，其中男36例、女24例，年齡(37.9±9.3)歲，Katafuchi積分0～3分17例、4～6分19例、7～9分15例、10～12分9例。排除合并糖尿病、慢性肝臟疾病、腫瘤、慢性感染者及妊娠、哺乳期女性。選擇泌尿外科因腎腫瘤進(jìn)行手術(shù)治療的患者20例為對(duì)照組，其中男9例、女11例，年齡(48.3±10.3)歲。兩組及不同Katafuchi積分患者的年齡、性別、血膽固醇水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IgA腎病組中，Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分的患者24 h尿蛋白[9]逐漸升高、內(nèi)生肌酐清除率[10]逐漸降低，兩兩相比，P均<0.05。見表1。本研究獲南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者簽署知情同意書。

表1 各組年齡、血膽固醇、24 h尿蛋白、內(nèi)生肌酐清除率比較

1.2 尿外泌體中BAFF的檢測(cè) 留取各組患者清潔中段尿標(biāo)本10 mL，按外泌體提取試劑盒操作說明提取尿液外泌體。取3 mL尿液，于室溫下3 000 r/min離心15 min，取上清液加入1/3體積的試劑盒內(nèi)提取試劑，混勻后放入4 ℃冰箱過夜，然后室溫下10 000 r/min離心30 min，將得到的外泌體沉淀加入200 μL的外泌體緩沖液重新懸浮。采用ELISA法檢測(cè)尿外泌體中的BAFF，嚴(yán)格按照說明書操作。在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)稀釋濃度，計(jì)算出各標(biāo)本中BAFF水平。

1.3 腎臟組織中BAFF的檢測(cè) IgA腎病組留取病腎組織、對(duì)照組留取瘤旁正常腎組織。所需標(biāo)本用4%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟處理，包埋成蠟塊，切片，烘干，脫蠟，抗原修復(fù)。3% H2O2室溫孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，置于pH 6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，0.01 mol/L的PBS沖洗3 min×3次。加一抗兔抗人BAFF抗體(1∶200稀釋)4 ℃過夜，一抗孵育結(jié)束后PBS沖洗。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000 稀釋)，室溫孵育30 min，PBS洗滌，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。光鏡下觀察、拍照。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為BAFF陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，采用Image Pro Plus6.0軟件測(cè)定積分光密度值并取平均值，以此表示BAFF相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 尿外泌體中BAFF水平變化及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系 IgA腎病組、對(duì)照組患者尿外泌體中BAFF水平分別為(190.07±22.35)、(102.46±16.21)ng/L；IgA腎病組中，Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分的患者BAFF水平分別為(139.34±18.01)、(168.39±21.09)、(215.70±20.94)、(268.49±27.23)ng/L。IgA腎病組尿外泌體中BAFF水平高于對(duì)照組(P<0.05)；IgA腎病組中Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分的患者BAFF水平逐漸增高，兩兩相比，P均<0.05。IgA腎病組尿外泌體中BAFF水平與Katafuchi積分(r=0.71)及24 h蛋白尿(r=0.67)呈正相關(guān)(P均<0.05)，與內(nèi)生肌酐清除率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.78，P<0.05)，與膽固醇含量無明顯相關(guān)性(r=0.12，P>0.05)。

2.2 腎臟組織中BAFF表達(dá)變化及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系 IgA腎病組、對(duì)照組患者腎臟組織中BAFF相對(duì)表達(dá)量分別為4.67±1.32、1.08±0.60；IgA腎病組中，Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分的患者BAFF相對(duì)表達(dá)量分別為2.39±0.80、3.98±0.90、5.87±1.10、7.38±1.80。見圖1。IgA腎病組腎臟組織中BAFF相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)；IgA腎病組中Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分的患者BAFF相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，兩兩相比，P均<0.05。IgA腎病組腎臟組織中BAFF表達(dá)與Katafuchi積分呈正相關(guān)(r=0.76，P<0.05)。

注：A為對(duì)照組；B、C、D、E分別為IgA腎病組Katafuchi積分0～3分、4～6分、7～9分、10～12分者。

2.3 尿外泌體、腎臟組織中BAFF表達(dá)的相關(guān)性 IgA腎病組尿外泌體中BAFF水平與腎臟組織中BAFF相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。

3 討論

目前對(duì)于IgA腎病的診斷及病情判斷主要依靠腎活檢，對(duì)于疾病活動(dòng)性的連續(xù)監(jiān)測(cè)尚缺乏有效的措施。患者尿蛋白檢測(cè)容易受多方面因素的影響，因此需尋求一種創(chuàng)傷性小的、更具價(jià)值的檢測(cè)手段。

IgA腎病發(fā)病機(jī)制涉及B細(xì)胞的活化及異常糖基化IgA1在腎臟的沉積等[11～13]。其中BAFF是B細(xì)胞激活的重要因子，可誘導(dǎo)B細(xì)胞增生、分化并分泌免疫球蛋白，在體液免疫中起重要作用。Xin等[14]研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者血漿BAFF水平高于對(duì)照組，且與Katafuchi積分呈正相關(guān)。McCarthy等[15]研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病小鼠血清中異常糖基化多聚IgA水平與BAFF高表達(dá)有關(guān)。在BAFF高表達(dá)的小鼠中，血清異常糖基化的IgA水平升高。因此推斷BAFF信號(hào)通路可能是IgA腎病發(fā)病機(jī)制中新的靶點(diǎn)。以上結(jié)果表明，BAFF可能在IgA腎病的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。

外泌體是一種直徑為30～200 nm的膜性囊泡，由活細(xì)胞選擇性包裝并釋放。外泌體內(nèi)攜帶多種脂質(zhì)、核酸及蛋白質(zhì)等[16,17]。外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)使其攜帶的蛋白完整性和穩(wěn)定性更高。不同細(xì)胞來源的外泌體所含蛋白種類差異很大。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，尿外泌體來源于泌尿系統(tǒng)組織細(xì)胞[18]。尿外泌體成分的變化可反映泌尿系統(tǒng)或全身性疾病的病理過程[19]，從而為泌尿系統(tǒng)甚至全身性生理或病理改變提供相關(guān)生物學(xué)信息。我們認(rèn)為，尿外泌體不僅可作為腎臟生物標(biāo)志物，亦有可能成為生物治療靶點(diǎn)之一。

目前，關(guān)于IgA腎病尿外泌體中BAFF水平及與病情的相關(guān)性鮮有報(bào)道，而尿液作為臨床診斷常用的標(biāo)本，與血清樣本等比較，具有無創(chuàng)、容易大量獲得等優(yōu)點(diǎn)，因而為其臨床應(yīng)用研究提供了極大便利。本研究選擇我院原發(fā)性IgA腎病患者，從尿液中分離出外泌體，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IgA腎病患者尿外泌體中BAFF水平顯著升高，且隨著病理損害的加重，BAFF水平明顯升高，二者呈正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，尿蛋白高的患者其尿外泌體中BAFF水平也明顯升高，二者呈正相關(guān)關(guān)系。而內(nèi)生肌酐清除率水平低的患者，其尿外泌體中BAFF水平升高，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這表明BAFF在IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定作用，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。同時(shí)，我們檢測(cè)IgA腎病患者腎臟組織中的BAFF，發(fā)現(xiàn)其與對(duì)照組相比明顯升高，且病理損害重的患者腎組織BAFF表達(dá)更高。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，患者尿外泌體中BAFF水平與腎臟組織中BAFF表達(dá)呈正相關(guān)，提示BAFF作為IgA腎病發(fā)生發(fā)展中的重要因子，與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，尿外泌體檢測(cè)和腎臟組織檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性。目前，尿外泌體中BAFF升高的機(jī)制尚不完全明確。有研究表明IgA腎病患者系膜細(xì)胞表面存在BAFF受體[20]，推測(cè)可能與系膜細(xì)胞結(jié)合后通過外泌體形式釋放有關(guān),這需要我們更進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，IgA腎病患者尿外泌體和腎臟組織中BAFF表達(dá)均升高，尿外泌體及腎臟組織中BAFF表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，且與IgA腎病的嚴(yán)重程度相關(guān),尿外泌體BAFF或可作為IgA腎病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。上述結(jié)果也為研究尿外泌體在腎小球疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。