Caspase抑制劑z-VAD-fmk對大鼠燒傷后小腸組織損傷、細胞凋亡的影響及機制

朱寶昌，孫娜，李紅衛

1 天津醫科大學朱憲彝紀念醫院 國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津300134；2 天津醫科大學總醫院 天津市神經病學研究所；3南開大學附屬醫院(天津市第四醫院)

燒傷后腸黏膜可較早出現相應損傷及并發癥[1]。以往研究表明，燒傷后所引起的腸黏膜細胞損傷和凋亡可能是小腸屏障功能損害的主要原因[2,3]。因此，針對重度燒傷后小腸組織細胞損傷和凋亡的有效治療成為目前研究的重點。在凋亡過程中，Caspase家族和B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)家族均發揮著重要的調控作用。其中，Caspase-3是凋亡過程中最為關鍵的執行蛋白酶，而Bcl-2和Bcl-2基因相關X基因(Bax)相互拮抗，共同起調控作用[4]。熱休克蛋白(HSPs)在細胞損傷過程中發揮重要作用，HSP70作為一種非特異性保護性蛋白可促進細胞修復，是評價細胞損傷程度的敏感指標[5]。既往研究證實，廣譜Caspase抑制劑z-VAD-fmk可通過抑制凋亡作用減輕肝炎模型中的肝損害[6]，還可通過抑制細胞凋亡提高體外培養牛胚胎的耐寒性[7]，增加體外犬卵泡的活性[8]。2019年2～8月，本研究用Wistar大鼠制作嚴重燒傷模型，并在早期給予z-VAD-fmk，觀察z-VAD-fmk對燒傷后大鼠小腸組織損傷和細胞凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 雄性Wistar大鼠96只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，體質量(200±20)g。z-VAD-fmk(5 mg/支)購自美國Sigma公司。TUNEL試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒購自BioVision公司。DU-7紫外分光光度計購自美國Beckman公司。日立F3010型熒光分光光度儀購自日本Hitachi公司。HSP70、Bcl-2、Bax兔抗大鼠一抗和羊抗兔二抗購自Abcam公司。

1.2 燒傷模型制備及給藥方法 將96只大鼠隨機分為治療組、致傷組、對照組，每組32只。參考黎鰲等[9]方法制作燒傷模型。造模前禁食水12 h，采用30 g/L的異戊巴比妥30 mg/kg腹腔麻醉，依據模型鼠體質量計算其30%體表面積，為造成30% TBSA Ⅲ度燒傷(病理切片證實)，將背部脫毛后的部分置于92 ℃水中，水浴18 s。造模后進行常規補液，參考Parkland公式(1% TBSA 4 mL/kg)，腹腔注射乳酸林格液。燒傷后動物分籠飼養，自由飲水、禁食。治療組致傷后即刻通過尾靜脈注射z-VAD-fmk 3 mg/kg，后每12 h經腹腔注射1次，劑量為1.5 mg/kg。致傷組給予等體積生理鹽水，注射方法及劑量同治療組。根據致傷組和治療組燒傷后的給藥量相應減少補液量。對照組不做處理。各組分別于造模后2、8、24、48 h各處死8只大鼠，采集標本，進行后續實驗。

1.3 小腸組織病理觀察 在各觀察時間點處死各組大鼠，并取小腸標本。灌注后剪開腹腔，取相同節段的小腸組織，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。采用Chiu′s 16級評分[10]評估小腸組織病理改變：正常黏膜絨毛計0分，上皮下間隙增大伴尖端毛細血管淤血計1分，上皮下間隙擴張伴上皮固有層分離計2分，絨毛兩側上皮大量固有層分離伴部分絨毛頂端有破損計3分，絨毛破損伴固有層毛細血管暴露計4分，固有層破壞、不完整、出血和潰瘍計5分。

1.4 小腸黏膜細胞凋亡相關指標檢測

1.4.1 凋亡指數(AI) 采用TUNEL染色。正常非凋亡細胞和陰性對照細胞被蘇木素復染呈藍色，核相對較大，形態大小較為一致；少量壞死細胞也呈陽性反應，但著色較淺；細胞核呈棕褐色或棕黃色著染判定為凋亡細胞。光鏡下(400×)隨機選擇5個視野進行觀察，計數每100個細胞中的凋亡細胞數，所得到的均值為AI。

1.4.2 Caspase-3活性 取各組小腸組織標本用于組織勻漿，并通過比色法檢測Caspase-3活性，以405 nm波長處的吸光度值(OD值)表示Caspase-3活性。

1.5 小腸組織中HSP70、Bcl-2、Bax檢測 采用二步法免疫組化染色。修復抗原酶后，首先采用BSA封閉，封閉完成后加入兔抗大鼠HSP70一抗(1∶100)、兔抗大鼠Bcl-2一抗(1∶75)、兔抗大鼠Bax一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜，洗片后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，洗片后加入DAB顯色，后蘇木素復染。呈棕黃色染色者為陽性細胞。光鏡下(400×)下隨機觀察5個視野，計算陽性細胞百分比，表示Bcl-2、Bax、HSP70表達情況。

2 結果

2.1 三組小腸組織病理變化 致傷組造模后2 h即表現為固有膜輕度水腫；造模后8 h表現最為嚴重，固有膜水腫情況加重，絨毛細胞排列紊亂，頂端有囊狀間隙出現，甚至死亡脫落；造模后24 h病理改變較前減輕，而48 h再次加重，但程度不及造模后8 h。對照組病理變化不明顯，小腸絨毛表皮細胞結構完整，排列整齊，邊緣光滑，黏膜無水腫及充血。治療組各觀察時點病理改變均較致傷組有不同程度的減輕。致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸組織病理評分高于對照組，治療組各時點評分均低于致傷組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組小腸組織病理評分比較(分，

2.2 三組小腸黏膜細胞凋亡相關指標比較

2.2.1 三組小腸黏膜細胞AI比較 致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸黏膜細胞AI高于對照組，治療組各時點AI均低于致傷組(P均<0.05)。見表2。

表2 三組小腸黏膜細胞AI比較

2.2.2 三組小腸黏膜細胞Caspase-3活性比較 致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸黏膜細胞Caspase-3活性高于對照組，治療組各時點Caspase-3活性均低于致傷組(P均<0.05)。見表3。

表3 三組小腸黏膜細胞Caspase-3活性比較

2.3 三組小腸組織中HSP70、Bcl-2、Bax表達比較 致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸組織中HSP70、Bcl-2、Bax表達均高于對照組，治療組各時點HSP70、Bcl-2表達高于對照組，Bax表達低于致傷組(P均<0.05)。見表4。

表4 三組小腸組織中HSP70、Bcl-2、Bax表達比較

3 討論

相關研究表明，重度燒傷后小腸細胞的損傷和凋亡表現出明顯增加的趨勢，尤其是燒傷的早期，最早可追溯到傷后2 h，在6～12 h呈現最高峰，可表現出特征性的形態學表現[11,12]。此外，小腸對缺血非常敏感，主要原因是其具有高代謝的特征，因此，即使缺血糾正后，其血管收縮仍將持續一定時間，可進一步加重腸黏膜損害[3]；并且，高分解代謝時產生的氧自由基及炎癥因子也可引起腸黏膜損傷，其中機械屏障破壞在重度燒傷引起多系統器官功能衰竭中的作用受到越來越多的重視[13]。小腸具有重要的屏障功能和免疫功能，其損傷會引起水腫和炎癥介質、毒素的釋放，進而引起全身反應[14]，嚴重時可危及生命。z-VAD-fmk是一種Caspase廣譜抑制劑，可與Caspase-3的催化位點結合，阻止凋亡級聯的引發劑(Caspase-8、Caspase-9)和(或)效應劑(Caspase-3)的活化，在其他模型中已得到廣泛證實可以有效減少細胞凋亡[7]。

本研究發現，致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸組織病理評分均高于對照組，治療組各時點評分均低于致傷組，提示z-VAD-fmk有助于減輕燒傷后小腸組織損傷。凋亡實驗結果顯示，大鼠燒傷后2 h即可觀察到小腸黏膜凋亡細胞增多，在8 h達到高峰，與相關研究結果一致；凋亡細胞數在24 h有所減低，48 h再度升高，考慮可能與小腸損傷后釋放細胞因子中的促修復及抑炎因子波動相關，尚需要進一步實驗證實。治療組造模后2、8、24、48 h小腸黏膜細胞AI均低于致傷組，表明z-VAD-fmk的作用與抗細胞凋亡有關。

大量研究表明，凋亡主要涉及的途徑包括線粒體途徑、內質網途徑及死亡受體途徑[15]。Caspase在細胞凋亡過程中起到關鍵的調控作用。Caspase-3為最主要的效應Caspase，在多個凋亡通路中具有關鍵地位[16]。在凋亡的過程中，Caspase-3活化往往提示凋亡已發展至不可逆階段，其活性的增高多出現于凋亡早期，而活性的減低往往出現于凋亡晚期[17]。因此，早期的細胞凋亡往往以Caspase-3的活性為主要觀察指標。本研究結果顯示，致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸黏膜細胞Caspase-3活性均高于對照組，治療組各時點Caspase-3活性均低于致傷組，提示z-VAD-fmk的抗細胞凋亡作用有Caspase-3的參與。

大量研究表明，另一大類凋亡關鍵因子Bcl-2家族在細胞凋亡過程中亦至關重要。Bcl-2家族主要分為兩大類，即Bcl-2亞家族和Bax亞家族。前者包括Bcl-2、Bcl-G等，發揮抑制細胞凋亡的作用[18]；后者包括Bax、Bak等，在凋亡過程中起促進作用，與Bcl-2等相互拮抗。Bax以非活性單體形式分布于胞質中，需接收凋亡信號刺激后方可發揮促凋亡作用，主要機制為破壞線粒體膜完整性以及對抗Bcl-2等抗凋亡因子[4]。既往研究發現，Caspase-3的激活在很大程度上依賴于細胞色素C的釋放，而Bcl-2和Bax是細胞色素C等物質釋放的關鍵調控因素，因此，三種因子在凋亡過程中起到至關重要的作用，是凋亡研究中常見的觀察指標。HSP家族被發現與細胞損傷過程緊密相關。HSP70作為細胞損傷的重要觀察指標，常被用來衡量細胞損傷和修復程度。本研究結果顯示，致傷組、治療組造模后2、8、24、48 h小腸組織中HSP70、Bcl-2、Bax表達均高于對照組，治療組各時點HSP70、Bcl-2表達均高于對照組，Bax表達均低于致傷組，提示燒傷后細胞凋亡可能與Caspase-3、Bcl-2和Bax相關，且HSP70在其中起到調節損傷的作用。

根據本研究結果，我們認為，在燒傷后小腸細胞損傷和凋亡的過程中，Caspase-3、Bcl-2和Bax扮演了關鍵的角色，Caspase-3、Bax起到促進凋亡的作用，Bcl-2則起到抗凋亡作用，而HSP70可減輕細胞損傷，與以往相關研究發現一致；并且，這個過程是燒傷早期即發生的，此過程可能與線粒體功能、鈣離子通道有關，尚需要進一步研究。z-VAD-fmk的抗損傷及凋亡作用明顯，根據以往研究及本研究能發現，Caspase-3是z-VAD-fmk的作用靶點，而Bcl-2、Bax表達變化是否為z-VAD-fmk的直接作用抑或通過調控Caspase-3的繼發改變尚需證實。另外，關于z-VAD-fmk在改善整體預后及生存率方面的作用仍有待繼續探索。