葡萄籽原花青素對(duì)穩(wěn)定apoE基因敲除小鼠易損斑塊的影響及機(jī)制

賈敏，路永剛，崔秋英，高偉，帖彥清

河北省人民醫(yī)院，石家莊050051

易損動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊是導(dǎo)致冠心病、心肌梗死、腦卒中等致死、致殘疾病的主要病因。AS斑塊的穩(wěn)定性與高脂血癥、代謝性疾病和吸煙等刺激因素導(dǎo)致的氧自由基增加及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1]。葡萄籽原花青素(GSP)是從葡萄籽中提取出的生物類黃酮[2],一種抗氧化劑和自由基清除劑。其抗氧化、清除自由基等作用優(yōu)于維生素C、維生素E，還具有抗炎、抗衰老、抗輻射等多種藥理作用[3,4]。但目前關(guān)于GSP對(duì)AS的療效研究相對(duì)較少，作用機(jī)制尚未闡明。2018年4月～2019年5月，我們制備了apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠AS模型，觀察GSP對(duì)AS易損斑塊的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，體質(zhì)量(20±2)g，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，室溫(22±0.2)℃，自由飲食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，給予1.25%膽固醇高脂飼料飼養(yǎng)，達(dá)到8周時(shí)即構(gòu)建易損斑塊動(dòng)物模型。隨機(jī)分為GSP低劑量組、GSP中劑量組、GSP高劑量組和模型組，每組6只。GSP低、中、高劑量組分別予以GSP溶液45、90、180 mg/(kg·d)灌胃，模型組給予同體積生理鹽水灌胃，各組均干預(yù)8周。

1.2 主動(dòng)脈根部斑塊面積測(cè)算 干預(yù)8周后，水合氯醛麻醉并固定小鼠，無(wú)菌條件下打開(kāi)小鼠胸腔，在生理壓下應(yīng)用冰生理鹽水灌流直至肝臟發(fā)白后，分離降主動(dòng)脈，多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，包埋，切片，HE染色后拍照。采用Graph Pad Prism6.0軟件測(cè)量主動(dòng)脈根部斑塊面積。

1.3 主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)容物面積測(cè)算 采用免疫組化及特殊染色法測(cè)算斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及膠原陽(yáng)性區(qū)域面積。主動(dòng)脈根部切片脫蠟至水，雙氧水去脫氧化物酶，羊血清封閉后加MAC-2一抗(1∶200稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育，PBS洗脫3次，加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗常溫孵育45 min后PBS洗脫3次，DAB顯色。棕色示巨噬細(xì)胞，紅色示膠原蛋白。使用IPP6.0軟件計(jì)算斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(棕色)和膠原(紅色)陽(yáng)性區(qū)域面積。

1.4 主動(dòng)脈根部活性氧(ROS)檢測(cè) 采用DHE熒光法檢測(cè)斑塊內(nèi)ROS水平。主動(dòng)脈根部石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，DHE終濃度選擇30 μmol/L，37 ℃孵育30 min后PBS沖洗未結(jié)合探針，避光保存。以斑塊內(nèi)DHE陽(yáng)性面積(紅色熒光所示)反映ROS水平。

1.5 主動(dòng)脈根部細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法檢測(cè)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。主動(dòng)脈根部連續(xù)石蠟切片，脫蠟后經(jīng)Proteinase K消化、加標(biāo)記緩沖液、生物標(biāo)記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Bioti)反應(yīng)后，再結(jié)合FITC。FITC在490～495 nm激化，在520～530 nm發(fā)射熒光，呈黃綠色，然后滴加抗熒光淬滅劑、封片后在熒光顯微鏡下采集斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡圖片并分析，凋亡的細(xì)胞核呈黃綠色。測(cè)算斑塊內(nèi)TUNEL陽(yáng)性面積，反映細(xì)胞凋亡情況。

1.6 降主動(dòng)脈凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cytc、cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)。取模型組與GSP高劑量組標(biāo)本，將液氮和降主動(dòng)脈一起放入研缽中研磨后，收集至1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液提取總蛋白(蛋白保存于-80 ℃冰箱中)，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣量20 μg，分離并轉(zhuǎn)膜5%脫脂奶封閉后加入相應(yīng)一抗(Cytc 1∶1 000、cleaved Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 500)4 ℃封閉過(guò)夜，加二抗(1∶10 000羊抗兔IgG洗滌)，37 ℃孵育2 h后加入發(fā)光劑，ECL顯色，掃描分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組主動(dòng)脈根部斑塊面積及斑塊內(nèi)容物面積比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積及斑塊內(nèi)容物面積比較

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈根部ROS水平及細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊ROS水平及細(xì)胞凋亡情況比較

2.3 各組降主動(dòng)脈凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組降主動(dòng)脈凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

AS斑塊是多種心腦血管疾病如心肌梗死、冠心病、腦梗死等疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)聚集引起的氧化損傷的過(guò)程。大量研究顯示，血管壁可產(chǎn)生多種ROS，可以直接對(duì)血管壁造成損害，如影響血管內(nèi)皮功能、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖等，參與AS的發(fā)生和發(fā)展[5～8]。GSP是從葡萄籽中提取出來(lái)的一類多酚化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，是一種有效的自由基清除劑和抗氧化劑。目前，GSP對(duì)AS的作用鮮有相關(guān)研究報(bào)道[1～4]。

斑塊面積是評(píng)估AS進(jìn)展最明顯的指標(biāo)。斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞是最主要的ROS來(lái)源，可分泌多種、大量的炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶如IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-2、MMP-9等，加速斑塊組織結(jié)構(gòu)破壞，募集更多循環(huán)單核-巨噬細(xì)胞，形成惡性循環(huán)。ROS可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡形成壞死核心，使AS軟化，促進(jìn)斑塊破裂和后期血栓形成，而膠原是AS的剛性成分，有利于維護(hù)斑塊成分，防止斑塊破裂[9～11]。本研究發(fā)現(xiàn)，GSP高劑量組主動(dòng)脈根部斑塊面積、巨噬細(xì)胞面積均低于模型組，膠原面積高于模型組，表明經(jīng)180 mg/kg GSP處理后，apoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊面積顯著減小，巨噬細(xì)胞減少并伴隨著膠原成分升高和壞死核心減少，提示GSP具有明顯的穩(wěn)定易損斑塊的作用。

ROS是促進(jìn)AS進(jìn)展的重要因素，參與了AS的所有過(guò)程，在正常狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，使細(xì)胞、器官處于正常狀態(tài)，而在AS斑塊中ROS明顯增多。本研究發(fā)現(xiàn)，GSP高劑量組主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)紅色熒光面積低于模型組，提示經(jīng)180 mg/kg GSP處理后斑塊內(nèi)ROS水平降低，表明GSP顯著減輕了小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

線粒體是參與凋亡的重要部位[12～15]，其中Cytc是線粒體呼吸鏈必備的一類色素蛋白，在激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了決定性作用。在巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Cytc通過(guò)線粒體外膜釋放，促凋亡因子刺激下Cytc從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中，之后激活Caspase-3啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]，其中最主要的促凋亡蛋白為Bax[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，GSP高劑量組主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)TUNEL陽(yáng)性面積低于模型組，GSP高劑量組促凋亡蛋白Cytc、cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)均低于模型組，提示GSP顯著抑制了上述3種促凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，180 mg/kg的GSP對(duì)小鼠主動(dòng)脈AS斑塊具有穩(wěn)定易損斑塊、減小斑塊面積、抑制巨噬細(xì)胞聚集及細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制可能與抑制ROS產(chǎn)生、減少促凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)，GSP有望作為心血管治療藥物新的研究方向。