miR-513b-5p表達變化對結腸癌細胞增殖、遷移的影響及機制探討

劉磊，杜攀，王芳，包迪，林立新

湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院，湖北襄陽441100

結腸癌(CC)是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，病死率居全球惡性腫瘤第三位[1]。CC在我國消化道腫瘤中發病率僅次于胃癌和食管癌[2]。由于早期篩查手段不足，大多數患者首次確診已發展為中晚期，失去手術根治機會[3]。近年來隨著內窺鏡檢查的普及，CC早期診斷水平有所進步，但是晚期CC患者的預后仍然很差[4]。因此，尋找有效的治療CC的途徑對改善患者預后意義重大。微小RNA(miRNA)為非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸[5]。miRNA通過與mRNA的3′ UTR結合調控靶基因表達，從而介導腫瘤的進展[6]。miR-513b-5p作為miRNA家族中的一員，其在鼻咽癌中低表達，并抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[7]。類似研究表明，miR-513a-5p可抑制視網膜母細胞瘤的增殖[8]。miR-513a-5p在CC中的作用及其機制尚未明確。有研究表明，重組人細胞信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)在CC中具有促進細胞生長的作用[9]，其發揮作用的上游機制尚不清楚。2016年7月～2018年7月，本研究觀察了CC組織、細胞中miR-513b-5p的表達變化，及miR-513b-5p對CC細胞增殖和遷移的影響，并探討相關機制，以期為臨床上治療CC提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及主要實驗材料 選擇2016～2018年本院收治的57例CC患者的CC組織及其癌旁組織，所有患者均經病理檢查確診為CC且未接受放化療，手術切除組織標本后，保存于-80 ℃冰箱。本研究經醫院倫理委員會批準，并獲得所有患者的書面知情同意。人CC細胞系HCT116、RKO、SW480、LoVo和SW620細胞均購自中科院典型培養物保藏委員會細胞庫。人結腸成纖維細胞(CCD-112CoN細胞)購自美國ATCC生物生物標準品資源中心。Lipofectamine 2000、空載質粒miR-con、過表達STAT3質粒、miR-513b-5p模擬物(miR-513b-5p mimics)和miR-513b-5p抑制劑(miR-513b-5p inhibitors)均購自美國Invitrogen公司。TRIzol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及SYBR PCR Master Mix購自美國Thermo Fischer公司。PVDF膜、CCK-8試劑盒和Transwell小室購自美國Millipore公司。RIPA裂解緩沖液購自碧云天生物技術公司。ECL試劑盒購于Amersham Pharmacia公司。熒光素酶活性檢測試劑盒、野生型STAT3(STAT3-WT)和突變型STAT3(STAT3-MUT)載體購于美國Promega公司。

1.2 CC組織和細胞中miR-513b-5p檢測 使用TRIzol法提取CC組織、癌旁組織和CC細胞、CCD-112CoN細胞的總RNA，檢測純度后將RNA反轉錄成cDNA，按照PCR試劑盒操作說明進行目的基因擴增。以U6(組織)GAPDH(細胞)作為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。每組實驗重復3次，結果取平均值。

1.3 miR-513b-5p表達抑制對CC細胞增殖、遷移的影響觀察 培養HCT116細胞，待細胞融合度達到80%～90%時進行傳代。HCT116細胞分為miR-con組、miR-513b-5p抑制劑組，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將miR-513b-5p inhibitors和miR-con轉染細胞。將兩組細胞按照2×103/孔接種于96孔板中。貼壁培養24 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm的吸光度值，以此表示轉染后0、1、2、3、4 d的細胞增殖能力。采用Transwell實驗檢測細胞遷移能力。取兩組細胞，胰酶消化后以1 000 r/min離心3 min，無血清RPMI-1640重懸細胞沉淀至密度為1×105/mL，取200 μL細胞懸液加入至Transwell小室上室，下室加入700 μL的含10% FBS的完全培養液，于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。取出小室，用棉簽輕輕將小室上室表面細胞擦去，晾干，用結晶紫溶液染色30 min，PBS洗滌2次，顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5個視野(100×)計數遷移細胞，每個樣本均設置3個復孔，實驗結果取均值。

1.4 miR-513b-5p與STAT3的靶向關系驗證 通過生物信息預測miR-513b-5p在STAT3上的結合位點并用PCR對STAT3上miR-513b-5p的結合位點進行擴增。將擴增片段插入到pmiR-GLO report載體，構建STAT3-WT質粒。用基因突變技術將部分核苷酸突變，構建STAT3-MUT質粒。分別用STAT3-WT、STAT3-MUT質粒和miR-513b-5p mimic、miR-con轉染HCT116細胞，用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，采用Western blotting法檢測STAT3蛋白。

1.5 STAT3過表達對CC細胞增殖、遷移的影響觀察 取部分HCT116細胞，分為miR-con組(轉染miR-con)、miR-513b-5p模擬物組(轉染miR-513b-5p mimics)、STAT3過表達組(共轉染STAT3過表達質粒和miR-513b-5p mimics)。采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞增殖能力，采用Transwell實驗檢測細胞遷移能力。

2 結果

2.1 CC組織和細胞中miR-513b-5p表達變化 CC組織和癌旁組織中miR-513b-5p相對表達量分別為0.410±0.053、1.000，CC組織miR-513b-5p表達低于癌旁組織(P<0.01)。HCT116、RKO、SW480、LoVo、SW620細胞及CCD-112CoN細胞中miR-513b-5p相對表達量分別為0.613±0.065、0.461±0.048、0.223±0.024、0.536±0.055、0.302±0.033、1.000，五種CC細胞miR-513b-5p相對表達量均低于CCD-112CoN細胞(P均<0.01)。

2.2 miR-513b-5p表達抑制對CC細胞增殖、遷移的影響 轉染0、1、2、3、4 d后，miR-513b-5p抑制劑組細胞增殖能力高于miR-con組(P均<0.05)，見表1。miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組細胞遷移數量分別為(52±11)、(21±2)個，miR-513b-5p抑制劑組細胞遷移能力高于miR-con組(P<0.01)。見圖1。

表1 轉染0、1、2、3、4 d后miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組細胞增殖能力比較

圖1 miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組Transwell實驗細胞遷移情況(結晶紫染色，100×)

2.3 miR-513b-5p與STAT3的靶向關系 StarBase在線分析數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php)顯示STAT3與miR-513b-5p存在結合位點。與miR-con組相比，miR-513b-5p模擬物組STAT3-WT細胞的熒光素酶活性降低(P<0.05)，相對熒光素酶活性分別為1.000±0.100和0.641±0.066。與miR-con組相比，miR-513b-5p模擬物組STAT3-MUT細胞的熒光素酶活性無顯著改變，相對熒光素酶活性分別為1.000±0.100和1.020±0.124。miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、miR-513b-5p抑制劑組STAT3蛋白相對表達量分別為1.000±0.100、0.310±0.034、2.510±0.311，miR-513b-5p模擬物組STAT3蛋白相對表達量低于miR-con組、miR-513b-5p抑制劑組STAT3蛋白相對表達量高于miR-con組(P均<0.01)。由此可見，miR-513b-5p可能靶向負調控STAT3。

2.4 STAT3過表達對CC細胞增殖、遷移的影響 轉染0、1、2、3、4 d后，miR-513b-5p模擬物組細胞增殖能力低于miR-con組，STAT3過表達組細胞增殖能力高于miR-513b-5p模擬物組，組間兩兩比較，P均<0.01。見表2。miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達組、miR-con組細胞遷移數量分別為(15±3)、(34±8)、(52±11)個，miR-513b-5p模擬物組細胞遷移數量低于miR-con組，STAT3過表達組細胞遷移數量高于miR-513b-5p模擬物組，組間兩兩比較，P均<0.01。見圖2。

表2 轉染后0、1、2、3、4 d miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達組細胞增殖能力比較

圖2 miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達組Transwell實驗細胞遷移情況(結晶紫染色，100×)

3 討論

miRNA是近年來研究發現的一種基因調控元件，通過協同或抑制作用共同調控靶基因，從而參與機體各種病理生理過程[10]。大量實驗證據表明，miRNA是一類重要的調控因子，可作為多種惡性腫瘤的預后標志物[11]。例如，miR-552在卵巢癌中表達上調，其高表達與患者不良預后密切；進一步研究表明miR-552通過靶向張力蛋白同源的磷酸酶促進卵巢癌細胞的生長和轉移[12]。而在骨肉瘤中，miR-618通過靶向Maelstrom在體內和體外抑制腫瘤的生長[13]。miRNA表達失調預示著患者預后更差，而且miRNA在功能上與腫瘤的發生和發展密切相關。本研究發現miR-513b-5p在CC組織和CC細胞中表達下調，miR-513b-5p抑制劑可促進HCT116細胞的增殖、遷移能力，而miR-513b-5p模擬物可抑制HCT116細胞的增殖、遷移能力，這表明miR-513b-5p在CC中可作為抑癌基因發揮作用。

通常，miRNA可通過堿基配對方式與位于mRNA 3′UTR的互補序列結合，導致mRNA的降解或翻譯抑制，從而影響腫瘤的生長和轉移。迄今為止科學家們已在人體內發現超過1 400種miRNA，這些基因占人類基因組的1%～3%，而30%～60%的蛋白質編碼基因由miRNA來調節[14]。據文獻報道，miR-195-5p在CC中表達下調，并與患者生存期短密切相關；進一步研究表明miR-195-5p通過靶向調節Yes相關蛋白1抑制CC的生長和轉移[15]。類似研究報道，miR-495在CC中直接靶向FA83D蛋白抗體(FAM83D)抑制CC的生長；進一步研究表明PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號通路參與miR-495/FAM83D軸介導的CC的進展[16]。本研究為進一步探究miR-513b-5p的下游靶點，通過StarBase數據庫分析發現，STAT3是miR-513b-5p的潛在靶點，體外實驗則表明miR-513b-5p可通過靶向負調控STAT3抑制CC細胞的增殖和遷移。

STAT3在CC中被頻繁激活，從而表達異常，發揮致癌作用[17]。據研究，STAT3在維持干細胞表型重要基因的表達方面起著重要作用。STAT3通路在富含腫瘤干細胞(CSC)標記的細胞亞群中優先激活。CD133是一種可標記CSC的跨膜糖蛋白，而活化的STAT3可通過與NF-κB和缺氧誘導因子1α的聯合作用上調CD133表達，這表明STAT3可作為CSC的標志物[18]。此外，STAT3在腫瘤細胞和腫瘤浸潤的免疫細胞中均被激活，激活的STAT3發生磷酸化、同型二聚化、核易位和DNA結合，促進腫瘤生長、血管生成、侵襲和免疫逃逸，從而持續促進腫瘤進展[19]。因此，本研究通過熒光素酶活性實驗和Western blotting檢測證實了miR-513b-5p可直接靶向STAT3并負調節后者的表達；功能實驗表明過表達STAT3可部分逆轉miR-513b-5p模擬物對CC細胞增殖和遷移的抑制作用。

總之，本研究發現，miR-513b-5p在CC組織和細胞中低表達，miR-513b-5p表達下調可增強細胞增殖和遷移；miR-513b-5p可能通過靶向負調控STAT3起到抑制CC細胞增殖和遷移的作用。本研究尚存在一些不足之處，如STAT3的下游信號轉導途徑和miR-513b-5p的上游靶基因不明確，需進一步探究。此外，仍需要更大樣本的實驗研究完善上述結論。