TRIM55在胃癌組織、細胞中的表達變化及其與腫瘤惡性生物學行為的關系

田樹波，劉景磊，彭利盼，孔帥

山東第一醫科大學附屬省立醫院，濟南250021

胃癌是嚴重影響人們健康和威脅生命的常見腫瘤[1]。胃癌治療主要是以手術為主的綜合治療[2]。胃癌的發生發展機制還未完全闡明，并且缺乏有效的早期診斷標志物。因此，尋找和鑒定胃癌分子標志物，對于胃癌的早期診斷、治療及預后評估十分重要。三結構域蛋白(TRIM)家族由眾多成員構成[3]，部分成員在腫瘤發生發展過程中參與了細胞的轉錄調控、細胞的增殖凋亡等過程，從而發揮促癌或抑癌的作用[4,5]。TRIM家族蛋白結構多樣性的特點，決定了其功能的多樣性。TRIM55也稱肌肉特異性RING鋅指蛋白2(Murf 2)，其可維持肌肉發育和心肌功能。TRIM55在骨骼肌分化和肌纖維生成的早期階段發揮重要作用[6]。研究表明，在SARS-CoV感染中，miR-30-5-5p可以調控TRIM55的表達[7]。TRIM55在肝癌組織中低表達，是肝癌的獨立預后因素，其可以通過上皮-間質轉化(EMT)和MMP2通路調節肝癌細胞的侵襲轉移[8]。本研究觀察了胃癌組織中TRIM55的表達變化，探討TRIM55與預后的關系，以及TRIM55對胃癌細胞惡性生物學行為的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 胃癌組織及細胞來源 選取山東省立醫院胃腸外科2014年7月～2015年12月收治的具有完整隨訪資料的91例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁正常胃黏膜組織標本，所有組織均經HE染色病理檢查證實。91例患者中，男61例、女30例，平均年齡63.6歲。收集患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤病理分期及淋巴結轉移情況等資料。隨訪自術后1個月開始，主要是以電話和門診復診的方式，隨訪至患者死亡或截至2019年12月。91例中，死亡56例，存活35例。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。胃癌MGC803細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，并于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。當細胞融合度至80%～90%時按照1∶2比例將細胞傳代。

1.2 胃癌組織中TRIM55檢測 將胃癌組織制作成病理組織芯片，然后進行染色。先用二甲苯進行脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復。PBS洗4次后用BSA封閉液37 ℃封閉，滴加TRIM55一抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS洗4次。按照免疫組化檢測試劑盒說明書，加入二抗，室溫孵育20 min。PBS清洗后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶結合物，孵育20 min。用DAB進行染色，鏡下觀察著色情況，終止顯色后用蘇木素復染，脫水。加入二甲苯透明后用中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察并拍照，用圖像分析軟件對圖片進行分析。根據染色強度評分，無著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色為3分；按陽性細胞百分比評分，無陽性細胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。兩項得分相乘，≥4為TRIM55高表達。

1.3 TRIM55低表達后胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力觀察

1.3.1 細胞分組及TRIM55 siRNA轉染 將胃癌細胞分為兩組，即轉染靶向TRIM55的siRNA組(si-TRIM55組)和轉染陰性對照干擾組(si-NC組)。根據TRIM55的CDS編碼序列，構建靶向TRIM55基因片段的siRNA。siRNA-TRIM55上游序列為5′-AUCAAACUUCUCACAAAGCUC-3′，下游序列為5′-GCUUUGUGAGAAGUUUGAUUA-3′；陰性對照si-NC上游序列為5′-UUCAUUUAGGGAGUUCAACCA-3′，下游序列為5′-GUUGAACUCCCUAAAUGAAUG-3′。應用Lipofectamine2000分別將siRNA-TRIM55或si-NC轉染MGC803細胞。應用TRIzol試劑提取胃癌細胞中的總RNA，分光光度計下測定OD260/280值，測定RNA濃度。采用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，采用real-time PCR法檢測TRIM55，以GAPDH為內參。TRIM55上游引物序列為5′-GGTTTTGGATAGACATGGGGT-3′，下游引物序列為5′-TTCTCCTCTTGGGTTCGGGT-3′。以2-ΔΔCt表示TRIM55的相對表達量。結果si-TRIM55組TRIM55 mRNA相對表達量低于si-NC組(P<0.05)，轉染成功。

1.3.2 胃癌細胞增殖能力觀察 胃癌細胞培養于6孔板中，轉染36 h后，將細胞以2×103個/孔的密度接種到96孔板中，分別于24、48、72、96 h后向每孔加入10 μL的CCK-8，于培養箱孵育4 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(OD450)，根據OD值繪制細胞生長曲線。

1.3.3 胃癌細胞遷移、侵襲能力觀察 取對數生長期的胃癌細胞，胰酶消化后以無血清培養基重懸并調整細胞密度為1×106/mL，取200 μL接種于Transwell板的上室，下室內加入含10%胎牛血清的培養基。侵襲實驗需要在小室內膜表面鋪基質膠。細胞于培養箱中培養48 h后，棄去上室內培養基并用棉簽擦去上室內殘余細胞，多聚甲醛固定下室細胞30 min后用結晶紫染色，于顯微鏡下觀察下室內細胞的數量。

2 結果

2.1 胃癌組織中TRIM55表達變化及與腫瘤臨床病理參數的關系 TRIM55定位于細胞核與細胞膜，呈棕褐色顆粒，主要表達于細胞核(圖1)。91例胃癌組織中TRIM55高表達40例，癌旁組織中TRIM55低表達，胃癌組織中TRIM55高表達率高于癌旁組織(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤位置和Lauren分型患者TRIM55表達差異均無統計學意義(P均>0.05)。Ⅰ+Ⅱ期者TRIM55高表達率低于Ⅲ期者，無淋巴結轉移者TRIM55高表達率低于有淋巴結轉移者，T1+T2期者TRIM55高表達率低于T3+T4期者(P均<0.05)。詳見表1。

注：A為癌旁正常胃黏膜組織；B為高分化胃癌組織；C為低分化胃癌組織；D為胃印戒細胞癌組織。

2.2 TRIM55表達與胃癌預后的關系 TRIM55高表達患者5年生存率低于低表達者(P=0.026，圖2)。TRIM55高表達、低表達患者中位總生存期(OS)分別為34個月(95%CI:13.3～62.8)、57個月(95%CI:25.5～84.5)，TRIM55高表達者中位OS短于低表達者(P<0.05)。單因素COX回歸分析結果顯示，腫瘤T分期、淋巴結轉移、腫瘤TNM分期和TRIM55表達水平是胃癌患者預后的影響因素；進一步行多因素COX回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、TRIM55表達水平是胃癌預后的獨立影響因素(見表2)。

2.3 TRIM55低表達后胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力變化 si-TRIM55組培養24、48、72、96 h細胞增殖能力均低于si-NC組(P均<0.05)，見表3。遷移實驗結果顯示，si-TRIM55組、si-NC組穿膜細胞數分別為(117.6±6.4)、(223.4±16.3)個，侵襲實驗結果顯示，si-TRIM55組、si-NC組穿膜細胞數分別為(76.8±5.2)、(158.5±7.6)個，兩組穿膜細胞數相比，P均<0.05。見圖3。

表1 不同臨床病理參數胃癌患者TRIM55高表達情況比較

圖2 TRIM55表達與胃癌患者生存率的關系

3 討論

TRIM55屬于TRIM蛋白家族，其在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用。TRIM蛋白擁有3個特征性結構域，作為E3連接酶發揮作用，可以介導蛋白的泛素化，通過降解靶分子，進而參與調節細胞內的病理生理過程和腫瘤相關進程[9～11]。TRIM蛋白主要通過調節p53及NF-κB信號通路等多種機制，影響腫瘤相關因子表達而發揮促癌或抑癌的作用[12～14]。TRIM59在乳腺癌中過表達并與較高的TNM分期和淋巴結轉移相關，其過表達可以促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移，增強腫瘤細胞對順鉑的耐藥性；TRIM59過表達還可以促進乳腺癌細胞p53的泛素化過程，導致p53降解，促進腫瘤進展[15]。TRIM24蛋白在胃癌中高表達，并且與胃癌的臨床分期、局部侵犯和較差的預后有關；TRIM24過表達也可導致胃癌細胞對5-FU耐藥并促進胃癌細胞生長[16]。還有研究表明，TRIM32的表達與胃癌較差的預后相關，其作為促增殖、抗凋亡因子參與胃癌的AKT信號通路調節，還可以通過靶向胃癌細胞中的GLUT1和HKⅡ加強糖酵解[17]。研究表明，TRIM55在結直腸癌中定位于細胞核且高表達，TRIM55陽性表達患者5年生存率明顯低于陰性患者[18]。TRIM55作為E3泛素連接酶可以通過影響細胞因子信號轉導抑制因子1的表達進而促進結直腸癌細胞增殖[19]。一項納入芬蘭心力衰竭人群的研究顯示，TRIM55表達缺失或TRIM55 E140K變異體過表達與心臟收縮能力減弱密切相關[20]。還有研究報道，TRIM55在系膜增生性腎小球腎炎的發展過程中起到調節TNF-α-CCL2通路、促發炎癥反應的作用[21]。

表2 胃癌患者預后影響因素COX分析結果

表3 si-TRIM55組、si-NC組培養不同時間細胞增殖能力比較

注：A為遷移實驗；B為侵襲實驗。

本研究首次探討了TRIM55在胃癌中的表達及生物學功能，通過組織芯片免疫組化法檢測了TRIM55在91例胃癌組織和癌旁組織中的表達，結果表明TRIM55在胃癌組織中高表達，生存分析顯示TRIM55高表達者5年生存率和OS降低，COX回歸分析也證實TRIM55是胃癌預后的獨立影響因素。分析TRIM55表達與胃癌臨床病理參數的關系，結果顯示，TRIM55表達與胃癌T分期、淋巴結轉移和TNM分期有關。以上結果提示，TRIM55可能參與了胃癌的發生發展過程。

為了研究TRIM55在胃癌細胞中的功能，我們構建了靶向TRIM55的siRNA，轉染至胃癌MGC803細胞中，降低TRIM55的內源性表達。通過CCK-8增殖實驗證實，敲低TRIM55基因并使其低表達可以明顯抑制胃癌細胞的增殖。Transwell實驗表明，胃癌細胞轉染TRIM55 siRNA后，能夠穿過基底膜的細胞數目明顯減少。這些結果提示，TRIM55在胃癌中可能發揮癌基因的功能，降低其表達可以抑制胃癌細胞的惡性增殖過程，抑制胃癌細胞的侵襲和轉移。

綜上，本研究探討了TRIM55作為腫瘤促進因子的生物學效應，TRIM55在胃癌組織中高表達，有望作為胃癌預后不良的獨立標志物。但是TRIM55促進胃癌細胞侵襲、轉移的分子生物學機制未知，下一步應繼續探討其具體作用的信號通路，以期為胃癌的臨床治療提供新的治療策略和分子靶點。