膿毒癥患者外周血單個核細胞STAT3 mRNA表達及其對預后的預測價值

謝璨燦，曾維忠，吳雙華，李崢嶸，黃冰

株洲中心醫院，湖南株洲412007

膿毒癥是一種由細菌或真菌進入血液感染人體免疫系統和凝血系統而引起的致死性綜合征。多種炎癥因子在巨噬細胞介導下，通過各種信號轉導通路，導致炎癥介質的級聯式或瀑布式效應，從而加速中性粒細胞與內皮細胞黏附，激活凝血系統，最終發展為膿毒癥[1～3]。膿毒癥患者一旦出現膿毒癥休克，病死率明顯增加[4,5]。尋找特異度和敏感度更高的生物標志物作為膿毒癥的早期診斷指標一直是學者們研究的重點。信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)可能是膿毒癥所致功能障礙的關鍵調控基因[6]。近年來，有關STAT3參與膿毒癥機制的研究取得了一定進展[7]。研究發現，STAT3在膿毒癥中異常表達，其不僅可以直接調控促炎因子和抑炎因子的表達釋放，還可作用于炎癥信號傳導通路的其他關鍵分子間接調控膿毒癥的發生發展。STAT1和STAT3有望作為預測膿毒癥合并多器官功能障礙的新標志物[8～10]。急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHEⅡ)是臨床上最權威的危重癥病情評估系統，已廣泛應用于危重癥患者病情嚴重程度的評價[11]。本研究觀察了膿毒癥患者外周血單個核細胞中STAT3 mRNA的表達變化，探討其與病情嚴重程度的相關性，進一步分析STAT3 mRNA對膿毒癥患者預后的預測價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1～11月株洲市中心醫院收治的膿毒癥患者92例(膿毒癥組，男62例、女30例)以及同期入院體檢的健康志愿者20例(對照組，男10例、女10例)作為研究對象。兩組性別、年齡資料有可比性。膿毒癥診斷符合2016年美國重癥醫學會和歐洲危重病醫學會聯合發布的最新膿毒癥定義SEPSIS3.0中的診斷標準。排除住院時間少于24 h者，惡性腫瘤、先天性或繼發性免疫功能缺陷性疾病患者，病歷資料記錄不完整者。膿毒癥組入院時進行APACHEⅡ評分>30分(高危)26例、20～30分(中危)48例、10～<20分(低危)18例；28 d內存活50例、死亡42例，存活者、死亡者入院時血清降鈣素原(PCT)水平分別為(31.82±41.08)、(37.15±38.25)ng/mL，血乳酸(Lac)水平分別為(2.84±2.27)、(6.26±4.74)mmol/L。本研究符合醫學倫理學標準，經醫院醫學倫理委員會審批通過，研究方案獲得患者或家屬知情同意。

1.2 外周血單個核細胞STAT3 mRNA檢測 膿毒癥組于確診6 h內、對照組于同時取靜脈血10 mL，加入EDTA抗凝管，使用淋巴細胞分離液常規分離外周血單個核細胞，加入RNA穩定劑中保存，置于-70 ℃冰箱保存待檢。以TRIzol法常規提取淋巴細胞總RNA，取少量RNA溶液，用紫外分光光度計分別測波長260、280 nm的吸光度(A)值，以A260/A280≥1.8為合格樣品，獲取RNA濃度值。采用TaKaRa PrimScript逆轉錄試劑盒，按照說明書將RNA逆轉錄為cDNA。依據GenBank提供的GAPDH及STAT3基因序列，采用Pmerremier5.0軟件設計人源引物。內參GAPDH上游引物序列為5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，下游引物序列為5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。STAT3 mRNA上游引物序列為5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物序列為5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書上實時定量PCR儀(AB7500)進行反應，反應條件為95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 膿毒癥組外周血單個核細胞中STAT3 mRNA表達變化 膿毒癥組、對照組外周血單個核細胞中STAT3 mRNA相對表達量分別為1.93±0.30、1.00±0.14，膿毒癥組STAT3 mRNA相對表達量高于對照組(P<0.01)。膿毒癥組中，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相對表達量分別為1.77±0.27、1.93±0.27、2.17±0.22，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相對表達量逐漸升高，兩兩相比，P均<0.05；存活、死亡患者STAT3 mRNA相對表達量分別為1.80±0.22、2.09±0.30，死亡患者STAT3 mRNA相對表達量高于存活者(P<0.01)。

2.2 膿毒癥組STAT3 mRNA表達與APACHEⅡ評分、PCT、Lac的相關性 Pearson相關分析顯示，膿毒癥組外周血單個核細胞STAT3 mRNA表達水平與APACHEⅡ評分、Lac呈正相關(r分別為0.719、0.332，P均<0.05)，與PCT無關(r=-0.097，P>0.05)。

2.3 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評分、PCT、Lac對膿毒癥患者死亡的預測價值 外周血單個核細胞STAT3 mRNA相對表達量預測膿毒癥患者死亡的ROC曲線下面積(AUC)為0.892(P<0.01)，最佳截斷值為3.06時敏感度為81%、特異度為88%；APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者死亡的ROC曲線下面積(AUC)為0.890(P<0.01)，最佳截斷值為24.5分時敏感度為81%、特異度為86%；而Lac、PCT等指標相較于前兩者預測價值較小。見圖1、表1。

圖1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評分、PCT、Lac預測膿毒癥患者死亡的ROC曲線

3 討論

膿毒癥的病理生理機制極其復雜，涉及一系列的炎癥與抗炎過程、體液與細胞反應，以及循環系統的異常等。目前膿毒癥的治療主要采用早期液體復蘇、使用血管活性藥物維持血壓以保證組織灌注、改善微循環、使用強效抗生素、使用激素增強血管活性藥物敏感性、床旁血液凈化等，如果不能糾正患者低灌注狀態，則可能發生膿毒癥休克，患者可出現高熱、凝血功能異常、多器官功能衰竭甚至死亡。雖然近年來膿毒癥休克的治療流程和手段更加規范，患者病死率有所降低，但膿毒癥的早期診治仍有局限性，使得該病的治療依然面臨嚴峻挑戰。

STAT3是細胞內調控炎癥的主要信號通路，在膿毒癥中起重要作用[12]。在膿毒癥早期，大量促炎因子如IL-6、TNF-α通過STAT3通路引發炎癥級聯瀑布效應[13]。而有研究表明，感染性休克時血清IL-6水平持續升高，患者死亡率也會隨之上升[14]。血漿IL-6和TNF-α水平均很高的敗血癥患者一般預后不良。Kamezaki等[15]發現LPS通過Tyk2進而激活STAT1和STAT3信號通路，引起炎癥因子大量釋放，進而促發感染性休克。Herzig等[16]發現STAT3活化是CLP誘導感染性休克進程中的關鍵，并且與炎癥介質的釋放和器官功能障礙密切相關。Zhao等[17，18]發現STAT3抑制劑LL2可以抑制膿毒癥早期促炎因子表達，減輕炎癥反應，表明STAT3信號通路激活參與膿毒癥引起的炎癥反應，而抑制通路活性可減輕炎癥反應。有研究表明，STAT3的激活能誘導巨噬細胞對內毒素的反應性降低，這可能與膿毒癥的免疫抑制機制存在關聯。因此，靶向調控STAT3的表達為干預膿毒癥提供了一個新的方向[19]。

表1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ評分、PCT、Lac對膿毒癥患者死亡的預測價值

APACHEⅡ評分是目前國內外較為認可的危重癥病情評價系統，它是針對患者急性生理和慢性健康狀況的綜合評價體系，其分值越高表明患者的狀態越差，死亡的可能性越大。APACHEⅡ評分能夠較為全面地反映患者機體狀況和評估危重患者預后[20]。膿毒癥涉及的生物標志物種類繁多。有學者[21]估算文獻報道的有關膿毒癥的生物標志物超過178種，目前應用最廣泛的為PCT。膿毒癥經目標導向治療后，PCT值下降通常提示患者預后改善，如果PCT值維持原水平或較前升高則提示患者預后不佳。PCT對膿毒癥預后的判斷具有一定的參考價值[22]。血清Lac檢測通常被納入危重疾病的臨床管理，特別是在嚴重膿毒癥和膿毒癥休克的情況下。血清Lac水平升高被認為是組織缺氧的標志，通常在臨床上用作評價膿毒癥嚴重程度和預后的指標。高濃度的血清Lac可能是患者死亡的預測指標，而Lac水平降低與預后改善有關[4,23,24]。

本研究觀察了膿毒癥患者外周血單個核細胞中STAT3 mRNA表達變化，結果發現膿毒癥組STAT3 mRNA相對表達量高于對照組；膿毒癥組中，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相對表達量逐漸升高，死亡患者STAT3 mRNA相對表達量高于存活者；膿毒癥組外周血單個核細胞STAT3 mRNA表達水平與APACHEⅡ評分、Lac呈正相關，與PCT無關。這表明膿毒癥患者STAT3 mRNA表達水平升高，且可能與患者的病情嚴重程度和預后有關，STAT3表達水平高的膿毒癥患者預后較差，死亡風險較高。進一步分析STAT3 mRNA及其他常用指標對膿毒癥患者預后的預測價值，結果顯示，外周血單個核細胞STAT3 mRNA相對表達量預測膿毒癥患者死亡的AUC為0.892，最佳截斷值為3.06時敏感度為81%、特異度為88%；APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者死亡的AUC為0.890，最佳截斷值為24.5分時敏感度為81%、特異度為86%。這表明STAT3 mRNA相對于其他指標對膿毒癥患者死亡有更好的預測價值。

綜上所述，膿毒癥患者外周血單個核細胞中STAT3 mRNA相對表達量升高，與患者APACHEⅡ評分及28 d內預后有關；檢測膿毒癥患者外周血單個核細胞中的STAT3 mRNA有助于反映疾病嚴重程度并預測預后。STAT3有望成為膿毒癥早期診斷和治療評估的關鍵性指標。然而本研究尚存在一定局限性，由于膿毒癥休克患者病情危重，未能收集更多樣本信息，之后研究應納入更多患者，以驗證上述結論。