牛 PLIN1基因CDS區擴增及時序表達

雷召雄，魏大為，汪書哲，楊夢麗，馬 云

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

牛肉具有高蛋白、低膽固醇、營養價值高等特點，深受消費者歡迎。有研究報道，牛肉發酵成香腸還可以保留乳酸菌等對人體有益的菌種[1]。近年來牛肉的消費量逐年攀升，牛肉中肌內脂肪含量(IMF)直接影響牛肉的感官特征和大理石花紋的形成[2]。目前，肌內脂肪的含量和成分已經成為評判牛肉品質的重要指標[3]。此外，肌內脂肪中的不飽和脂肪酸具有促進細胞代謝、降低心腦血管疾病發生概率以及抗癌和提高機體免疫力的功能[4-5]。脂肪的生成是一種由調節細胞代謝的激素、酶和代謝物共同作用下的復雜的代謝過程[6]，近年來，關于脂肪生成的研究大多集中在調控脂肪代謝的轉錄因子，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)、固醇調節元件結合蛋白-1C(Sterol regulatory element-binding protein 1C，SREBP-1C)、脂肪酸結合蛋白-4(Fatty acid binding protein-4，FABP4)等基因及相關信號通路上。

圍脂滴蛋白1(Perilipin1, PLIN1)是脂滴相關蛋白家族的核心成員之一。PLIN1通過與激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)和甘油三酯脂肪酶(ATGL)相互作用調節脂肪生成[7]。基礎狀態下，PLIN1包被在脂滴表面，防止HSL和ATGL接觸到脂滴[8]，當能量需求增加或促炎細胞因子刺激下，大脂滴分解為小脂滴，相對表面積增加，其表達量減少，同時，PLIN1和HSL蛋白的多個絲氨酸位點被磷酸化，導致對脂滴的保護作用減弱，進而促進脂肪的降解[9-10]。研究認為PLIN1在脂肪生成過程中起關鍵作用，與脂肪組織中線粒體生物發生相關基因呈正的相互作用[11]。已有許多研究報道了PLIN1在脂滴表面調控脂肪分解的轉錄機制，PKA磷酸化PLIN1是HSL由細胞質轉移到細胞核中直接與脂滴接觸的重要條件[12]。先前的報道顯示，在人類成熟的白色脂肪細胞中PLIN1可以激活脂肪細胞特異性脂滴相關蛋白Cidec/Fsp27，從而顯著增加脂質交換、轉移和脂滴的生長[7]。研究表明，PLIN1基因在肥胖人群中高表達，已作為人類肥胖風險的候選因子[13]。PLIN1蛋白對脂肪分解的調控還受到表觀遺傳的影響，即PLIN1啟動子區的CpG甲基化水平[14]，如，PLIN1的甲基化水平會影響1～7周齡的脂肪型雞和瘦肉型雞體內PLIN1的mRNA水平和腹部脂肪百分比[15]。小鼠模型中的研究表明，PLIN1缺乏會導致脂肪含量降低，同時證明敲除PLIN1可能是一種抵抗肥胖的有效途徑[16-17]。以上研究提示PLIN1已作為脂肪生成的關鍵調節因子，但是對牛脂肪代謝的調控機制目前尚不完全清楚。

因此，本試驗欲通過基因克隆的方法得到牛PLIN1的編碼區全長序列；并利用qPCR檢測PLIN1在牛前體脂肪細胞誘導分化過程中的表達模式，為進一步揭示PLIN1調控牛脂肪生成的分子機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織樣采集 用于基因克隆的荷斯坦公牛為2歲左右，由寧夏農墾賀蘭山清真牛羊產業(集團)有限公司提供。于屠宰點采集荷斯坦牛腹部脂肪、背部脂肪和腎周脂肪，快速用手術剪分離成黃豆大小放入凍存管投入到液氮罐中，帶回實驗室凍存于-80 ℃冰箱，備用。

1.1.2 細胞樣采集 用于時序分析的脂肪細胞來自荷斯坦牛皮下脂肪組織，于屠宰點分離后置于含雙抗體積分數為1%的PBS中帶回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織總RNA的提取和cDNA的獲得 采用組織塊研磨的方法并按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，利用核酸定量儀檢測總RNA的質量濃度及OD值(OD260/OD280的比值在1.8～2.0時符合要求)。并根據反轉錄試劑盒說明書將獲得的總RNA反轉錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2PLIN1基因CDS區擴增 根據Gen-Bank(登錄號：NM_001083699.1)上公布的牛PLIN1的序列，利用Primer 5.0軟件設計PCR引物(表1)，由通用生物系統(安徽)有限公司合成。PCR反應體系為15 μL：2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL，采用降落式PCR設計多循環反應程序：第1 次循環，預變性5 min(95 ℃)，變性30 s(95 ℃)，復性30 s(61 ℃)，退火130 s(72 ℃)，10個循環，每個循環溫度降低1 ℃；第 2 次循環，變性30 s(95 ℃)，復性30 s(61 ℃)，退火130 s(72 ℃)，延伸5 min(72 ℃)，30個循 環。PCR產物3 μL用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物信息

1.2.3PLIN1基因T載體連接及測序 將降落PCR擴增所得的目的基因用膠回收試劑盒純化回收，并用PMD-18T載體在4 ℃過夜連接，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞后，挑選陽性菌落，采用菌液PCR驗證后，將含有目標片段的菌液送往通用生物系統(安徽)有限公司進行測序。

1.2.4 牛皮下脂肪細胞的分離培養 采用組織塊法和消化法分離培養牛皮下前體脂肪細胞，方法參照文獻[18]。

1.2.5 牛前體脂肪細胞的誘導分化 待F3代細胞融合度達到100%時，將培養基更換為誘導分化培養基(含10 μg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX和1 μmol/L羅格列酮的完全培養基)，誘導2 d后，小心棄去誘導分化培養基，加維持分化培養基(含10 μg/mL胰島素和1 μmol/L羅格列酮的完全培養基)，每2 d換液1 次并收集一批細胞。誘導10 d后，收獲最后一批細胞，用于qPCR分析。

1.2.6 細胞總RNA的提取及PLIN1時序表達譜檢測 細胞總RNA的提取方法、檢測方法及保存方法同組織提取法。采用qPCR技術檢測牛皮下脂肪細胞分化0 d、2 d、4 d、6 d、10 d中PLIN1的相對表達水平，同時檢測成脂標志基因PPARγ在脂肪細胞分化過程中的表達模式，以細胞cDNA(原液稀釋5倍)為模板進行實時熒光定量PCR，反應體系：SYBR Green 7.5 μL，cDNA 4 μL(cDNA原液稀釋5倍)，10 μmol/L 上下游引物各0.3 μL，RNase-free ddH2O 2.9 μL。反應程序：預變性3 min(95 ℃)，變性10 s(95 ℃)，退火20 s(60 ℃)，延伸30 s(72 ℃)，設置40個循環，內參基因選用β-肌動蛋白(β-Actin)。

1.2.7 數據分析 2-ΔΔCt法分析熒光定量的結果，數據以“平均值±標準誤”表示。用SPSS 18.0軟件進行單因素方差(one-way ANOVA)分析，其中P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牛 PLIN1基因序列分析

根據牛PLIN1序列設計特異性引物，采用RT-PCR的方法擴增得到牛PLIN1基因，預測擴增片段長度為1 717 bp(圖1-A)。測序后分析可得其CDS區長度為1 551 bp，編碼517個氨基酸，利用Chromas軟件分析測序結果，發現均為單一峰(圖1-B)，利用DNAMAN軟件將克隆得到的序列與NCBI已有數據比對，發現相似度高達99.42%(圖1-C)。表明克隆獲得的序列是牛PLIN1基因CDS區。

A.牛 PLIN1基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；B. PLIN1基因pDM-18T載體測序圖譜；C.測序得到的牛 PLIN1基因序列與數據庫已有序列比對結果

2.2 分離培養牛前體脂肪細胞

采用組織塊法和消化法分別分離培養牛前體脂肪細胞，組織塊接種到培養皿10 d 后可觀察到組織塊周圍游離出大量細胞(圖2-A)，隨即消化貼壁細胞，進行融合培養，待培養皿中細胞密度達到90%以上(圖2-B)后凍存，備用；消化法分離的牛前體脂肪細胞在培養第3天即觀察到少量細胞(圖2-C)，培養到第10天后視細胞生長密度(圖2-D)進行凍存，備用。

A.組織塊法培養10 d后；B.組織塊完全融合；C.消化法分離培養3 d后；D.消化法完全融合

2.3 誘導分化牛前體脂肪細胞

復蘇事先分離凍存的牛前體脂肪細胞，培養8 d(圖3-A)后將二代細胞傳代繼續培養至融合度達到90%以上，然后傳代至六孔板中，繼續培養 6 d后(圖3-B)細胞基本融合。

二代完全融合的牛前體脂肪細胞(A)，三代完全融合的牛前體脂肪細胞(B)

2.4 牛 PLIN1和 PPARγ細胞時序表達分析

qPCR檢測PLIN1和PPARγ基因在牛前體脂肪細胞分化過程中的表達模式，結果如圖4所示。PLIN1基因在脂肪細胞分化的第0天幾乎不表達，隨著分化時間的推移，PLIN1表達量逐漸上升，第6天顯著升高(P<0.05)，直到分化的終末階段，第10天時表達量達到最大(P<0.01)；PPARγ在脂肪細胞分化的第0天就開始表達，之后不斷上調，在第6天和第10天時差異達到顯著水平(P<0.05)。

相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異達到極顯著水平(P<0.01)

3 討 論

脂肪細胞是機體正常生理的關鍵調節器，包括能量平衡、營養穩態和組織穩態[19]，白色脂肪細胞在哺乳動物體內以脂滴儲存的形式作為主要的能量平衡器官，也是重要的內分泌器官，能分泌激素和細胞因子[20]，隨著多房脂滴的出現，白色脂肪細胞向棕色脂肪細胞轉化，化學能轉變成熱能[21]。PLIN1蛋白定位于脂滴表面，與脂滴表面脂肪酶發生互作，調控脂肪的代謝[20]。因此，本研究克隆得到牛PLIN1基因的編碼區序列，并研究PLIN1在牛前體脂肪細胞分化過程中的表達模式，為解決PLIN1調控牛脂肪代謝的分子機制提供基礎參考數據。

本研究得到牛PLIN1基因的CDS區全長為1 551 bp，編碼517個氨基酸，與NCBI數據庫中的結果一致，先前在人類上的研究表明，PLIN1基因與女性的體質量指數呈現顯著的正相關，同時推測PLIN1基因調節人體的體質量和代謝變量[22]，由于PLIN1蛋白參與脂肪組織中三酰甘油的水解過程，因此，研究者在PLIN1突變的小鼠模型中發現脂肪量顯著降低[23]；以上報道說明PLIN1的表達與脂肪的代謝密切相關。因此，本試驗采用組織塊法和消化法分離培養牛前體脂肪細胞，鑒定在脂肪細胞誘導分化過程中PLIN1的表達模式，前期分離得到貼壁生長并在形態多呈圓形或橢圓形的脂肪細胞，研究顯示，前體脂肪細胞在培養的分化過程中多為圓形，并且隨分化時間的增加，逐漸出現脂滴的聚集[24]，由此，本試驗成功分離得到了牛前體脂肪細胞。

PPARγ是調節脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子。在PLIN1基因啟動子區存在功能性的PPARγ的特異性應答元件PREE[25]，在脂肪組織中PPARγ與PREE結合激活PLIN1的表達。同時多項研究證明，過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路與脂肪的發生密切相關，PLIN1顯著富集在PPAR信號通路中[26-27]。因此，在本試驗中分離培養牛前體脂肪細胞，并對其進行誘導分化，同時檢測PLIN1和PPARγ在細胞分化過程中的表達模式，結果顯示，PLIN1在誘導分化的0 d不表達，此后表達量逐漸上升，與第2天相比，在分化的第6天(P<0.05)和第10天(P<0.01)表達量達到最大，由此推測，PLIN1的高表達可能是因為細胞內脂滴聚集的結果。最近在秦川牛上的研究結果同時表明PLIN1在牛脂肪組織中表達量最高，在細胞分化的第6天和第8天表達量最高，第10天有所下降[28]，與本研究中隨著分化的進行表達量逐漸增加的結果有差異。該報道中并未分析第10天脂肪細胞中PLIN1表達量下調的原因，后續將繼續開展重復試驗驗證兩種結果。PPARγ在牛前體脂肪細胞分化的第0天低表達，此后逐漸上升，在分化的第10天(P<0.05)達到最大，先前有研究者報道的在牛前體脂肪細胞分化過程中PPARγ的表達模式與本研究得到的結果一致[29]。以上研究結果進一步證實PPARγ激活了PLIN1基因的表達，脂肪組織中PLIN1特異性高表達的轉錄調控機制將是后續研究的重點。

本試驗利用基因克隆的方法得到牛PLIN1基因CDS區全長序列；采用組織塊法和酶消化法成功分離得到牛前體脂肪細胞；利用qPCR技術檢測在牛前體脂肪細胞分化過程中PLIN1和PPARγ的表達模式，為進一步解析PLIN1調控牛脂肪組織生成的分子機制提供參考數據。