人腦膜瘤中ATF3 maspin和MMP2表達研究

馬斯奇 孫逸杰 朱旭強 李雪元 吳立新 閆東明

鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

腦膜瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，世界衛(wèi)生組織(WHO)將腦膜瘤分為三級，Ⅰ級為良性(80% 以上)，Ⅱ級為不典型(15%～20%)，Ⅲ 級為惡性(1%～3%)[1]。大多數(shù)腦膜瘤為良性，臨床預后較好[2]，然而對于惡性腦膜瘤，治療效果差，預后差，易復發(fā)(復發(fā)率可達80%)，中位生存期僅1～2 a，5 a內(nèi)病死率約68%[3]，患者病死率、致殘率明顯增加[4]。腦膜瘤浸潤性生長和復發(fā)的重要病理環(huán)節(jié)是細胞異常增殖與侵襲，多種增殖基因和侵襲基因異常表達[5]，但具體的分子機制仍未明確。因此，探討腦膜瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲、轉移的相關機制成為醫(yī)學界廣泛關注的焦點。本研究采用免疫組織化學法、qRT-PCR和Western blot法檢測激活轉錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制因子(mammary serine protease inhibitor，maspin)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)在正常腦組織和各病理級別腦膜瘤組織中的mRNA和蛋白表達情況，探討ATF3、maspin和MMP2在腦膜瘤組織發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移及預后評估中的作用，為發(fā)現(xiàn)新的腦膜瘤治療靶點提供幫助。

1 材料與方法

1．1標本來源觀察組選取鄭州大學第一附屬醫(yī)院2019-01—2020-06手術切除的腦膜瘤標本71例，男33例，女38例，年齡25～69(41±2.7)歲。所有病理結果均由病理科明確診斷，Ⅰ級腦膜瘤50例，Ⅱ級15例，Ⅲ級6例(WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤2007年分類標準)。正常腦組織標本為手術切除的同期顱腦外傷病人的挫傷腦組織標本32例，男20例，女12例，年齡6～61(37.7±6.2)歲。本研究由院道德倫理委員會批準，每一位參與患者均已充分溝通并簽署相關告知同意書，患者同意參加此項研究。

1．2主要試劑ATF3、maspin和MMP2兔抗人多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體、內(nèi)參β-actin、DAB顯色試劑盒、Western blot所用的組織裂解液和化學發(fā)光試劑均從美國Santa Cruz公司采購。全部PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒和組織RNA提取試劑盒均從美國Invitrogen公司采購。

1．3實驗方法

1．3．1 免疫組化：按試劑盒說明嚴格進行實驗過程。常規(guī)組化制片、細胞爬片、梯度酒精脫水。組織切片和細胞爬片均用0.3 % H2O2甲醇溶液室溫孵育30 min，0.1% TritonX-100中冰浴5 min。三個基因組織切片抗體工作濃度為1∶200，細胞爬片工作濃度為1∶100，顯微鏡下DAB顯色。陽性染色為胞漿或胞核中出現(xiàn)黃色顆粒或棕黃色，以H-score(H=I×P)系統(tǒng)[6]為參照。每張切片取5個高倍視野(×400倍)，隨機計數(shù)100個細胞，求其平均陽性率。

1．3．2 RT-PCR：嚴格按照說明書進行總RNA提取、逆轉錄PCR、實時熒光定量PCR步驟，內(nèi)參為β-actin，ATF3上游引物為：5′-CCTCGGAAGTGAG TGCTTCT-3′，下游引物為：5′-ATGGCAAACCTCAGCTCTTC-3′；maspin上游引物為：5′-AGACATTCTCGCTTCCCTGA-3′，下游引物為：5′-AATTTTGACC CCTTATGGGC-3′；MMP2上游引物為：5′-GCTATGGACTTGGG AGAA-3′，下游引物為：5′-TGGAACGGAATGGAAAC-3′。實時熒光定量PCR反應條件為：95 ℃，5 min，循環(huán)條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共40個循環(huán)。參照LIVAK等[7]的研究方法(△△CT法)，得到各組樣本三個基因mRNA表達量的相對比值進行統(tǒng)計學分析。

1．3．3 Western blot：從-80 ℃取出組織樣本，按照Western blot常規(guī)步驟進行操作，組織裂解、冰孵，兩次離心，10% SDS-PAGE膠分離，半干法轉膜后封閉1 h。工作濃度1∶1 000一抗4 ℃過夜后，二抗(工作濃度1∶2 000)在37 ℃條件下孵育2 h，ECL法和X線膠片曝光，掃描膠片，分析ATF3、maspin和MMP2三種蛋白與β-actin的積分光密度的比值。

1．4統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。秩和檢驗比較等級資料，Mann-WhitneyU檢驗等級資料的兩樣本比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1各病理級別腦膜瘤組織和正常腦組織中三個基因免疫組化蛋白分布和表達

2．1．1 ATF3蛋白表達情況：腦膜瘤組織陽性表達率為46.5%(33/71)，正常腦組織18.8%(6/32)，P<0.043，見表1。ATF3蛋白在Ⅰ級腦膜瘤細胞呈散在分布，在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中廣發(fā)分布，而微弱表達于正常腦組織中(圖1)。ATF3蛋白在Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤組織中陽性表達與正常腦組織相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.003 3)(表1)。ATF3蛋白表達與腦膜瘤病理分級呈正相關(ρ=0.621，P<0.041)。

圖1 ATF3的表達(免疫組化 ×400)A：正常腦組織；B：腦膜瘤WHO Ⅰ級；C：腦膜瘤WHO Ⅱ級；D：腦膜瘤WHO Ⅲ級Figure 1 ATF3 expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．1．2 mapin蛋白表達情況：腦膜瘤組織和正常腦組織中maspin蛋白陽性表達率分別為76.1%(54/71)和93.8%(30/32)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。細胞胞核和(或)胞漿出現(xiàn)棕色或淺黃色顆粒為maspin蛋白陽性表達，在正常腦組織中呈強陽性表達，在Ⅰ級腦膜瘤中多呈棕黃色，在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中多呈淺黃色，呈不均勻散在分布或彌漫分布(圖2)。Ⅰ級腦膜瘤組織中maspin蛋白的陽性表達與正常腦組織相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤組織中maspin蛋白的陽性表達與正常腦組織相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。maspin蛋白表達與腦膜瘤病理分級呈負相關(ρ=-0.517，P<0.01)。

圖2 Maspin的表達(免疫組化 ×400)A：正常腦組織；B：腦膜瘤WHO Ⅰ級；C：腦膜瘤WHO Ⅱ級；D：腦膜瘤WHO Ⅲ級Figure 2 Maspin expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．1．3 MMP2蛋白表達情況：腦膜瘤組織陽性表達率為42.3%(30/71)，正常腦組織為12.5%(4/32)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。腫瘤細胞胞漿出現(xiàn)棕色顆粒視為MMP2蛋白陽性表達，少量細胞核也有染色，在Ⅰ級腦膜瘤組織中呈散在分布，在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤組織中彌漫分布，而在正常腦組織中無表達或微弱表達(圖3)。MMP2蛋白陽性表達在Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤組織與正常腦組織中相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。MMP2蛋白表達與腦膜瘤病理分級呈正相關(ρ=0.564，P<0.007)。

表1 ATF3、maspin和MMP2蛋白在腦組織的陽性表達情況 [n(%)]

圖3 MMP2的表達(免疫組化 ×400)A：正常腦組織；B：腦膜瘤WHO Ⅰ級；C：腦膜瘤WHO Ⅱ級；D：腦膜瘤WHO Ⅲ級Figure 3 MMP2 expression (immunohistochemistry ×400)A：Normal brain tissue；B：Meningioma WHO grade Ⅰ；C：Meningioma WHO grade Ⅱ；D：Meningioma WHO grade Ⅲ

2．2各病理級別、各級腦膜瘤組織和正常腦組織中三個基因mRNA相對定量如圖4～6所示，Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤中ATF3 mRNA的相對表達量分別是正常腦組織的(2.12±0.17)倍(P<0.042)、(4.93±0.41)倍(P<0.039)和(6.03±0.57)倍(P<0.047)；maspin mRNA在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中maspin mRNA表達相對量分別是正常腦組織的(0.47±0.07)倍和(0.25±0.04)倍，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤中MMP2 mRNA相對表達量分別是正常腦組織的(1.41±0.28)倍、(3.63±0.43)倍和(5.89±0.55)倍，均P<0.05。

注：與正常腦組織相比，*P<0.05

2．3各級腦膜細胞瘤中和正常腦組織三個基因的蛋白定量檢測結果如圖7所示，ATF3蛋白在正常腦組織和各級腦膜瘤中均有表達，在Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤中的相對表達量分別是正常腦組織的(2.45±0.21)倍、(5.27±0.43)倍和(6.39±0.54)倍，均P<0.05，見圖8。

圖7 ATF3、maspin和MMP2在各病理級別腦膜瘤和正常腦組織中的蛋白表達情況Figure 7 Protein expression of ATF3，maspin and MMP2 in various pathological grade meningioma and normal brain tissue

在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中maspin蛋白表達量分別為正常腦組織的(0.38±0.04)倍和(0.14±0.02)倍(P<0.05)；MMP2蛋白在Ⅰ～Ⅲ級腦膜瘤中的表達分別為正常腦組織的(1.59±0.2)倍、(3.39±0.3)倍和(5.54±0.35)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖8。

注：*、#和◆與正常腦組織相比，P<0.05

Spearman等級相關分析顯示，ATF3和MMP2蛋白表達與腦膜瘤病理分級呈正相關(ρ=0.627，P=0.007 5；ρ=0.691，P=0.007 1)，maspin蛋白表達與腦膜瘤病理分級呈負相關(ρ=-0.552，P=0.006 3)。

3 討論

ATF3是ATF/CREB家族的成員之一，參與人體的多種生理功能，包括維持細胞穩(wěn)態(tài)、損傷修復、細胞黏附、腫瘤細胞侵襲、細胞凋亡和信號轉導途徑等[8]。ATF3在正常細胞中低表達，但在多種體內(nèi)外應激信號如化療、缺氧、DNA損傷和細胞因子等誘導

注：與正常腦組織相比，#P<0.05圖5 腦膜瘤組織和正常腦組織maspin mRNA的總體差異比較Figure 5 Comparison of the overall difference of maspin mRNA between meningioma tissue and normal brain tissue

注：與正常腦組織相比，◆P<0.05

下表達能快速上調(diào)，從而上調(diào)其靶基因轉錄水平，引起細胞內(nèi)的一系列變化[9]。有本研究發(fā)現(xiàn)ATF3是一種致癌基因，加速細胞增殖，高表達于多種惡性腫瘤組織，與惡性腫瘤的侵襲、轉移及預后緊密相關[10]。JANZ等[11]研究發(fā)現(xiàn)與非何杰金氏病淋巴瘤和非惡性組織對比，何杰金氏病患者中ATF3的高度表達。宋魏等[12]研究顯示ATF3在乳腺浸潤性導管癌中的陽性表達率顯著高于癌旁乳腺組織，并與乳腺癌的組織學分級相關，結果表明與乳腺癌的侵襲及轉移能力與ATF3的高水平認真表達關系密切。LI等[13]的實驗表明肺癌的組織學分級、淋巴結轉移及總生存率降低與ATF3的高水平認真表達存在顯著相關性，提示ATF3表達上調(diào)可促進肺癌的遷移和侵襲。研究[14]顯示在正常腦組織中ATF3呈低水平表達，而在Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中，ATF3的表達逐級增強，且其表達與膠質(zhì)瘤病理分級呈正相關，也提示ATF3高表達與膠質(zhì)瘤的演進及惡性程度密切相關。這些研究表明ATF3表達促進了人癌細胞的增殖。本研究顯示腦膜瘤中ATF3的mRNA和蛋白表達

顯著高于正常腦組織，ATF3蛋白和mRNA表達與腦膜瘤病理分級呈正相關，提示腦膜瘤進展和侵襲機制與ATF3的高水平表達密切相關，可能成為評估患者預后的重要指標之一。

maspin是一種腫瘤抑制基因，通過抑制腫瘤細胞運動和誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的侵襲和轉移[15-16]。maspin蛋白高表達于多種正常人體組織，而在多種惡性腫瘤中如乳腺癌、肺癌、黑素瘤、口腔癌、胃癌和前列腺癌等中表達下調(diào)或不表達，常暗示預后不良[17-18]。研究[14]也顯示了相似的結果，在正常腦組織中maspin蛋白和mRNA呈高水平表達，但在Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中maspin呈低水平表達，隨著病理級別表達逐級減弱，其表達與膠質(zhì)瘤病理分級呈負相關。本研究同樣發(fā)現(xiàn)maspin在正常腦組織和I腦膜瘤中的蛋白和mRNA呈高水平表達，在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中maspin表達水平較低，且與腦膜瘤病理分級呈負相關，提示maspin與腦膜瘤的進展、復發(fā)及不良預后有關。

目前許多研究已經(jīng)證實MMP2是一種腫瘤促進基因，高表達于多種惡性腫瘤組織，如腦膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌等，它促進腫瘤形成新生血管，加速腫瘤細胞的浸潤和形成轉移灶[19]。多項研究[20]表明人腦膠質(zhì)瘤標本中MMP2呈高表達，MMP2表達水平與膠質(zhì)腫瘤細胞侵襲力密切相關。多項研究[21-22]發(fā)現(xiàn)腦膜瘤組織中MMP2的蛋白含量顯著高于正常腦膜組織，它與腦膜瘤組織內(nèi)細胞的增殖、侵襲與復發(fā)顯著相關。研究[14]也顯示了相似的結果，在正常腦組織中MMP2呈低水平表達，而在Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中MMP2的表達逐級增強，且其表達與膠質(zhì)瘤病理分級呈正相關。本研究顯示MMP2在腦膜瘤中的蛋白和mRNA表達明顯高于正常腦組織，MMP2蛋白和mRNA表達與腦膜瘤病理分級呈正相關，說明促侵襲基因MMP2的高表達與腦膜瘤惡性進展和不良預后密切相關。

本試驗表明ATF3、maspin和MMP2的表達與人腦腦膜瘤惡性分化程度密切相關，三個基因在各病理級別腦膜瘤之間比較差異有統(tǒng)計學意義，相關性研究發(fā)現(xiàn)，ATF3和MMP2在腦膜瘤中的表達呈正相關，ATF3和maspin在腦膜瘤中的表達呈負相關；在Ⅱ和Ⅲ級腦膜瘤中ATF3和MMP2表達較高，maspin表達較低；在Ⅰ級腦膜瘤中則相反，其具體的信號傳導機制還有待進一步研究證實。