多重連接探針擴增和二代測序技術(shù)檢測Duchenne型肌營養(yǎng)不良基因分析

何展文 陳啟慧 李平甘 吳若豪 李棟方 李 宇 周小琳 羅向陽

中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院，廣東 廣州 510120

Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是X連鎖隱性遺傳性致死性肌肉病，發(fā)病率(15.90～21.90)/10萬活產(chǎn)男嬰，臨床表現(xiàn)包括行走和蹲起困難、緩慢進展的全身骨骼肌無力和肌萎縮，小腿腓腸肌假性肥大、堅實，Gowers征陽性，多于9～12歲喪失行走能力[1]。DMD致病基因位于X染色體短臂-Xp21，包含79個外顯子，編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)[1-2]。抗萎縮蛋白的分子量為427 kD，是一種細胞骨架蛋白，位于肌膜的內(nèi)側(cè)，其氨基端與肌動蛋白連接，羧基端與肌膜的糖蛋白復(fù)合物結(jié)合，對維持細胞膜的穩(wěn)定，防止細胞壞死起重要作用。DMD基因突變導(dǎo)致表達產(chǎn)物dystrophin缺失或明顯缺乏，引起肌細胞膜結(jié)構(gòu)缺陷，可使細胞內(nèi)成分如肌酸激酶逸出，細胞外的鈣離子過多流入肌纖維，造成肌纖維的慢性進行性變性、壞死、再生、萎縮等一系列的病理生理變化。至今DMD仍無有效治療手段，臨床上多采用口服糖皮質(zhì)激素類，輔以營養(yǎng)支持、康復(fù)訓(xùn)練和呼吸支持等多學(xué)科管理改善疾病癥狀，但并不能改變疾病的最終結(jié)局。隨著基因治療的不斷發(fā)展和基因組編輯技術(shù)的不斷進步，從DMD的致病基因著手，有望為DMD的治療帶來新的希望。目前國內(nèi)外檢測DMD基因突變的主要方法是多重鏈接探針擴增技術(shù)(MLPA)，但該檢測方法只能檢出DMD基因大片段缺失和重復(fù)突變，不能檢測點突變[3]。隨著二代基因測序檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，二代測序可以檢測DMD基因點突變、微小缺失或插入突變等突變，更好地彌補了MPLA檢測不足[4]。本研究探討聯(lián)合應(yīng)用MLPA和二代基因測序技術(shù)對DMD遺傳學(xué)診斷的作用，為DMD的精準診治和指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育提供遺傳學(xué)依據(jù)[5]。

1 對象和方法

1．1研究對象收集2012-01—2019-12在中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院兒科神經(jīng)專科臨床診斷假性肥大型肌營養(yǎng)不良的住院兒童59例，均為男性患兒，就診年齡為11個月～15歲，平均4.72歲。臨床診斷依據(jù)：(1)男性患兒，運動能力異常，以雙下肢進行性近端肌無力、小腿腓腸肌假性肥大為主；(2)血清肌酸激酶(CK)明顯升高至正常值的10～50倍。本研究獲得患兒家長知情同意，同時獲中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準。

1．2方法

1．2．1 外周血DNA提取：抽取所有患者及部分家系成員外周靜脈血2 mL，2% EDTA抗凝。采用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德國)提取外周血DNA，按照說明書進行。

1．2．2DMD基因MLPA技術(shù)檢測：DNA樣品(50～200 ng)，98 ℃加熱5 min后冷卻到25 ℃，分別加入P034-A2/P035-A2探針(MRC-Holland，荷蘭)和MLPA buffer，混勻，95 ℃孵育1 min，60 ℃雜交16 h。雜交后將溫度降至54 ℃，加入Ligase-65混合物，54 ℃孵育15 min，98 ℃加熱5 min。將連接產(chǎn)物加入SALSA PCR引物，按照以下PCR程序擴增：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 20 min。將PCR產(chǎn)物置于分析儀上進行毛細管電泳，最后進行數(shù)據(jù)收集及分析。

1．2．3DMD基因測序：根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫中提供的DMD基因序列(NM 004006.2)，設(shè)計PCR引物，擴增片段包括DMD基因5’端啟動子區(qū)域、79個外顯子和3’端下游部分堿基，共86個片段。PCR擴增：反應(yīng)總體積為10 μL，包括正向引物(100 ng/μL)0.2 μL、反向引物(100 ng/μL)0.2 μL、DNA模板(100 ng/μL)0.2 μL、Taq酶預(yù)混液5 μL和ddH2O 4.1 μL。擴增條件：先95 ℃預(yù)變性11 min，然后95 ℃ 60 s，62 ℃ 35 s(以后每個循環(huán)降低1 ℃和延長2 s)，72 ℃ 100 s×10個循環(huán)，接著(95 ℃ 60 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s)×25個循環(huán)，再65 ℃ 20 min，4 ℃保存。測序與結(jié)果分析：用蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ處理擴增好的PCR產(chǎn)物，37 ℃孵育120 min，80 ℃ 15 min滅活蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ，上機測序。測序結(jié)果與標準序列進行比對分析，參照標準命名法命名所有微小突變。

2 結(jié)果

2．1臨床表現(xiàn)所有患兒均表現(xiàn)為運動功能異常，近端肌無力為主，肌張力低下，小腿肌肉假性肥大。血清肌酸激酶(CK)顯著升高(14 466±7824)U/L，肌酸激酶同工酶(CK-MB)中度升高(376±208)U/L。

2．2DMD基因MLPA分析59例患兒中28例(47.46%)為DMD外顯子缺失突變，7例(11.86%)為DMD基因外顯子重復(fù)突變，24例(40.67%)未檢出基因外顯子缺失或重復(fù)突變。7例DMD基因中有6種單外顯子缺失，分別涉及外顯子1、44、48、49、51和52，22例有多個外顯子缺失。圖1顯示DMD基因每個外顯子的缺失頻率情況。橫坐標顯示DMD基因第1-79外顯子的外顯子數(shù)目；縱坐標顯示每個外顯子的缺失頻率。根據(jù)DMD基因缺失總的分布頻率，在第45-55外顯子區(qū)域缺失頻率最高。

圖1 DMD基因外顯子的缺失頻率Figure 1 Frequency of exon deletion of DMD gene

2．3DMD基因微小突變分析利用基因測序檢測24例MLPA陰性患者與肌營養(yǎng)不良相關(guān)的微小突變，共檢出23例(38.98%)微小突變，其中包括無義突變8例(13.55%)，移碼突變6例(10.17%)，錯義突變6例(10.17%)，微缺失3例(5.08%)。Sanger測序用于驗證患者和攜帶者中潛在的致病性小突變。所有23個微小突變中，均分布在不同外顯子區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)點突變和微缺失熱點區(qū)。

應(yīng)用MLPA和第二代測序檢測1例患兒未發(fā)現(xiàn)外顯子缺失或重復(fù)、微小突變，該患兒通過肌肉病理檢查顯示肌纖維大小明顯不等，小纖維多為圓形或多邊形，可見較多肥大及劈裂纖維，可見小群灶狀分布的壞死伴吞噬及再生纖維，肌間質(zhì)結(jié)締組織明顯增生，肌間質(zhì)未見炎癥細胞；肌纖維膜Dystrophin-Rod/C/N表達普遍完全消失，臨床病理確診。

3 討論

DMD是兒童期最常見的致死性遺傳性肌肉病，是肌細胞膜上骨架蛋白抗肌萎縮蛋白(dystrophin)缺失所致，臨床表現(xiàn)為進行性肌無力和肌萎縮，并最終死于心力衰竭或呼吸衰竭[1]。隨著基因技術(shù)的發(fā)展和可用性，肌肉活檢診斷已逐漸被基因檢測所取代，基因檢測已成為DMD最新診治指南中的新金標準[6]。近年來基因治療進展能從DMD疾病發(fā)生的根源著手，為DMD患兒的帶來新的治療希望。

人類DMD基因位于Xp21.1 區(qū)域，全長約2.4 Mb，包含79個外顯子和78個內(nèi)含子，是目前已知的人類最大的基因。DMD基因突變大致可分為三類：外顯子缺失或重復(fù)突變、微小突變(包括堿基的置換、重復(fù)、缺失或插入)和剪切區(qū)突變[2]。MLPA作為一種高通量、針對基因序列進行定性和半定量分析的快速、簡單、可靠檢測手段，可以作為DMD基因檢測缺失/重復(fù)的一線篩查方法[7]。本研究運用MLPA技術(shù)檢測58例DMD患兒DMD基因，缺失突變47.46%，重復(fù)突變11.86%，點突變39.66%，缺失熱點區(qū)域為外顯子45-55。既往研究顯示，DMD基因缺失突變占55%～65%，重復(fù)突變占5%～15%，點突變占35%，而熱點缺失區(qū)分別在外顯子45-53的中央?yún)^(qū)和外顯子2-20的5’端[7-9]。本研究結(jié)果與國外報道基本相符，提示DMD基因突變類型及缺失分布規(guī)律并無明顯種族區(qū)別。外顯子跳躍治療是DMD研究最多的基因治療方法，研究顯示該治療具有較好的臨床應(yīng)用前景[10]。DMD基因突變熱點位于外顯子45-55，因此，針對外顯子51的跳躍治療是最高適用比例的跳躍治療方法，也是最早進行臨床試驗的外顯子跳躍治療方法。目前開展臨床試驗階段的外顯子51跳躍治療藥物是Drisapersen和Eteplirsen，兩者化學(xué)不同，Drisapersen的主要成分是2’O-甲基-硫代磷酸酯寡核苷酸(2’O MePS)，Eteplirsen是磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)。從已公布的臨床試驗結(jié)果可以看出，二種藥物雖有療效但并不顯著，且僅適用于特定類型的突變患者[11-14]。但隨著對外顯子跳躍治療藥物的研發(fā)，相信越來越多的患者會從中獲益。

本研究通過二代測序技術(shù)檢測出39.66%患兒發(fā)生DMD微小突變，其中13.55%為無義突變，10.17%為移碼突變，10.17%為錯義突變，5.08%為微缺失，并未發(fā)現(xiàn)微小突變發(fā)小最多的外顯子區(qū)域。無義突變由于堿基的改變導(dǎo)致終止密碼子(PTCs)提前出現(xiàn)，使肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生截短的、通常沒有正常功能的蛋白產(chǎn)物。PTC124是目前研究較多的無義突變通讀治療口服藥物，最初經(jīng)高通量藥物篩選鑒定并由美國PTC Therapeutics公司研發(fā)獲得，可以通過與核糖體亞基結(jié)合忽視無義突變產(chǎn)生的終止密碼子，使細胞產(chǎn)生全長而有功能的抗肌萎縮蛋白[15]。目前從該藥在國內(nèi)外多個臨床試驗治療效果來看，其對DMD具有一定的治療作用，但更多的臨床終點評價和長期治療效果尚待進一步隨訪和觀察[16-17]。

此外，本研究中1例患兒應(yīng)用MLPA和第二代測序檢測未發(fā)現(xiàn)外顯子缺失或重復(fù)、微小突變，該患兒最終通過肌肉病理檢查臨床確診為DMD。基因檢測技術(shù)能在基因水平上明確DMD診斷，但由于檢測技術(shù)水平等因素限制，或某些復(fù)雜突變和內(nèi)含子突變，仍有極少臨床病例需要結(jié)合病史和肌肉病理從蛋白質(zhì)水平明確臨床診斷。

總之，聯(lián)合應(yīng)用MLPA和二代基因測序技術(shù)是明確DMD致病基因突變位點最佳策略，能為DMD患兒的提供更加精準診治和家系成員的遺傳咨詢提供準確的依據(jù)，更好地避免患兒的出生，提高優(yōu)生優(yōu)育效果。