膿毒癥相關性腦病老年小鼠的腦轉錄組分析

徐震亞 郭 鐵 徐 娜 李宏賓 馮 敏 孫榮青

鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

膿毒癥相關性腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是伴隨膿毒癥發生的，在無直接的中樞神經系統感染、結構異常或其他類型腦病(如肝或腎性腦病)的情況下，出現彌漫性腦功能障礙[1]。SAE 通常表現為從嗜睡到昏迷程度不等的意識障礙，常伴有譫妄，注意力下降，思維混亂，其他癥狀還包括幻覺、睡眠節律異常和躁動，而且譫妄常出現于膿毒癥早期，對膿毒癥的早期診斷也是很有意義的線索[1]。關于SAE 的發病率，研究結果存在很大差異，為9%～71%，這與各研究采用的診斷標準不同有關[2]。研究顯示重癥監護病房中膿毒癥相關性腦病的發生率為17.7%[3]。患有菌血癥且被診斷出患有腎、肝或多器官功能障礙的患者，SAE 的發生率更高。一旦患者出現SAE，則預示著其與普通患者相比，具有更高的病死率，更多的重癥監護資源占用和更長的住院時間[4]。而SAE的發生，在老年患者中更為普遍[5]。因此，對老年SAE 進行研究，對降低老年膿毒癥患者的病死率，減少相關醫療費用具有重要意義。老年膿毒癥患者SAE的發病機制仍不清楚，目前研究顯示可能與內皮激活、血腦屏障改變、神經遞質改變等有關[6]。推測老年SAE患者與成年SAE患者的病理機制存在差異，對兩者進行腦組織轉錄組的分析，具有重要意義。但人腦組織樣本的獲取存在很大困難。從National Center for Biotechnology Information(NCBI)的Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫中發現，GODBOUT等[7]上傳的數據集GSE3253包含了老年和成年小鼠的腦組織基因表達芯片的數據，但并未對其進行生物信息學分析。因此，對該數據集進行了進一步生物信息學分析，以期發現老年SAE小鼠與成年SAE小鼠相比，其病理過程中獨特的關鍵基因及通路，來為進一步的研究指明方向。

1 芯片數據

數據集GSE3253來自于GEO數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE3253)。由于數據來自于公共數據庫，因此不需要倫理學審批。該數據集由 GODBOUT等[7]上傳，他們采用腹腔注射LPS的方法制作SAE動物模型[8-9]，研究包括成年組小鼠3只和老年組小鼠3只，采用[Mouse430_2]Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平臺進行基因表達分析。該研究設計嚴謹，數據詳實，但無進行充分的生物信息學分析。

2 方法

2．1差異基因的篩選使用GEO提供的GEO2R在線工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE3253)進行基因差異表達分析。GEO2R是GEO提供的基于R語言軟件包的在線分析工具[10]。首先通過value distribution功能對芯片數據表達值的可比性進行分析；設置P<0.01，同時|Log2Fold change|>1.5為篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的閾值。對于無基因注釋的探針位點數據，我們將其刪除；對于一個位點同時對應多個注釋基因的數據，我們將其刪除；對于同一基因對應多個探針位點數據的，我們保留P值最小的數據，其余數據刪除。

2．2基因本體論富集分析將得到的上調和下調的DEGs分別上傳至DAVID網站(https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)進行基因本體論(Gene ontology，GO)分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2．3KEGG通路富集分析將得到的上調和下調的DEGs分別上傳至DAVID網站(https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2．4蛋白互作分析將得到的全部DEGs上傳至STRING網站(https：//string-db.org/cgi/input.pl)進行蛋白互作分析。設置confidence score=0.7，將得到的蛋白互作數據使用cytoscape(version 3.5.1)進行可視化制圖。

3 結果

3．1DEGs的篩選通過差異表達基因的篩選，共篩選到305個DEGs，其中上調DEGs為157個，下調DEGs為148個。表1中分別列出了根據P值排列的前10個上調和下調的DEGs。可以發現，這些上調的基因與惡病質、脂肪代謝、腫瘤進展、細胞凋亡有關[11-12]。下調基因與基質的分解組裝[13]，免疫細胞的遷移，功能和存活[14]。見表1。

3．2基因本體論富集分析基因本體論包括三個分類：生物過程(Biological process，BP)，細胞成分(Cellular component，CC)，和分子功能(Molecular function，MF)。

3．2．1 Biological process：通過GO富集分析，在BP分類中，上調的157個DEGs富集到13個BPs，集中在細胞的分化、發生以及對應激的反應等；下調的148個DEGs富集到11個BPs，集中在離子轉運、凋亡的調控、對脂多糖的反應等。圖1A中列出了上調和下調的DEGs所富集到的前5項生物過程條目(根據P值排列)。

3．2．2 Cellular component：通過GO富集分析，在CC分類中，上調的157個DEGs富集到3個CCs，集中在細胞質、胞外區域；下調的148個DEGs富集到6個CCs，集中在胞核、胞膜和胞外區域。圖1B中列出了上調和下調的DEGs所富集到的細胞成分條目(根據P值排列)。

3．2．3 Molecular function：通過GO富集分析，在MF分類中，上調的157個DEGs富集到3個MFs，集中在代謝相關的功能；下調的148個DEGs富集到8個MFs，集中離子通道活性、激素活性相關功能。圖1C中列出了上調和下調的DEGs所富集到的分子功能條目(根據P值排列)。

注：紅色代表上調DEGs所富集到的GO條目，綠色代表下調DEGs所富集到的GO條目

3．3KEGG通路富集分析通過KEGG通路富集分析，上調的157個DEGs富集到4個通路，包括mmu05218：Melanoma(P=0.02)；mmu04015：Rap1 signaling pathway(P=0.03)；mmu04014：Ras signaling pathway(P=0.04)；mmu05200：Pathways in cancer(P=0.04)。下調的148個DEGs富集到3個通路，包括mmu05032：Morphine addiction(P=0.01)；mmu04060：Cytokine-cytokine receptor interaction(P=0.03)；mmu04721：Synaptic vesicle cycle(P=0.04)。圖2顯示了KEGG通路富集分析的結果(根據P值排列)，紅色代表上調通路，綠色代表下調通路。

注：紅色代表上調通路，綠色代表下調通路

3．4蛋白互作網絡分析通過PPI蛋白互作分析發現兩個主要的蛋白互作網絡，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1是這兩個互作網絡中的關鍵基因。圖3顯示了主要的基因蛋白相互作用的關系。

注：橢圓形標注為基因蛋白名稱，黑線代表兩者間存在調節作用

4 討論

通過對SAE的老年小鼠與成年小鼠腦組織基因表達芯片數據的對比分析發現，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1基因可能在老年SAE發病過程中具有重要作用。

Gngt1 (log2 FC=4.22)在眼睛和大腦都有表達[15]，它參與了胰島素抵抗途徑[16]，參與了PIK3-AKT信號通路[17]，其在炎癥反應過程中有重要作用。本研究中發現，相對于成年SAE小鼠，老年SAE小鼠Gngt1的表達是上調的，其會增加老年SAE患者腦損傷的發生。

SUCNR1 (log2 FC=2.86)是一種G蛋白偶聯受體，在缺血、缺氧等應激反應中起重要作用。SUCNR1的激活促進了巨噬細胞的抗炎表型，并增強了這些細胞對白介素4等的反應，在巨噬細胞的抗炎反應中具有關鍵作用[18]。巨噬細胞中SUCNR1的激活對于肥胖者脂肪組織的浸潤和炎癥均很重要，并且表明SUCNR1是肥胖誘導2型糖尿病有希望的治療靶標[19]。另外，SUCNR1在腎素誘導的高血壓，局部缺血/再灌注損傷，炎癥和免疫反應，血小板聚集和視網膜血管生成中也具有重要作用[20]。LUKYANOVA等[21]研究發現，SUCNR1相關的信號通路對大腦缺氧耐受形成有重要作用。一次低氧暴露，會在15～60 min內誘導SUCNR1在大腦皮層中表達，這與對機體缺氧的緊急耐受性形成有關。缺氧期間，腦皮質特異性SUCNR1的即時表達與GABA旁路的活性有關。Sucnr1具有抗炎和促進大腦對缺氧的耐受作用，相對于成年SAE患者，老年SAE患者Sucnr1表達的升高具有保護作用。

BDKRB2(log2 FC=3.48)可以增加血腦屏障通透性[22]，在中樞神經系統免疫反應中起重要作用[23]。BDKRB2對完整激肽具有高度親和力，激肽介導廣泛的生物學作用，包括疼痛、炎癥、血管舒張以及平滑的核收縮和松弛[24]。緩激肽是激肽的一種，優先結合BDKRB2，可以在早期階段通過內皮細胞中的BDKRB2受體增加血管通透性，并通過在基質細胞中BDKRB2受體在后期階段促進血管內皮生長因子(VEGF)的上調來促進血管生成。本研究發現老年SAE小鼠Bdkrb2表達較成年SAE小鼠顯著升高，說明其對血腦屏障的破壞作用在老年SAE發生中有更重要的作用。

EXO1(log2 FC=3.53)是一種5'→3'核酸外切酶，有助于調節細胞周期檢查點，維持DNA修復途徑，它的缺乏會導致DNA雙鏈斷裂，細胞周期停滯，細胞死亡或細胞轉化。EXO1在保護基因組穩定性中起到重要作用[25]。結合本研究，老年SAE小鼠對基因組穩定性的保護優于成年SAE小鼠。

Cdk1(log2 FC=-2.64)在神經元受損后表達上調，初級皮層神經元培養物暴露于氧葡萄糖剝奪(OGD)4 h會導致神經元細胞死亡并誘導Cdk1表達。Cdk1敲除的小鼠神經元顯示出對OGD誘導的神經元細胞死亡的部分抗性[26]。老年SAE小鼠Cdk1表達較成年SAE小鼠顯著升高，導致老年SAE神經元細胞死亡增加。

研究發現炎癥和血腦屏障的破壞在老年SAE的發病中起到了關鍵作用，Gngt1、Sucnr1、Bdkrb2、Exo1、Cdk1基因可能在老年SAE發病過程中具有重要作用，這為進一步對老年SAE發病機制的研究指明了方向。本研究的缺點在于芯片數據的樣本量較小，而結果是基于對既往研究數據的分析得到的，由于臨床中腦組織樣本獲得存在極大困難，而血腦屏障的存在，腦組織中蛋白水平的變化與血液中蛋白水平的變化并不一致，會在進一步的研究中對這方面的缺陷進行改進。