KLF7對骨髓間充質干細胞增殖和施萬樣細胞分化的影響

孫廣大 李文媛 馬 多 王 瑩△

1)牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011 2)牡丹江醫學院神經組織工程研究所，黑龍江 牡丹江 157011

周圍神經損傷(peripheral nerve injury，PNI)在發達國家發病率為每年(13～23)/100 000人，盡管PNI損傷不會危及患者生命，但其可能導致患者完全功能喪失或永久性損害，嚴重影響生活質量，并給患者和社會帶來巨大經濟壓力[1]。PNI損傷分為神經營養不良、軸突斷裂和神經切斷。細胞治療作為一種神經修復策略，由于具有自我更新、高增殖率和多能等特性，因此能夠在周圍神經系統中創造良好的神經再生微環境[2]。施萬細胞(Schwann cells，SCs)是周圍神經膠質細胞，在周圍神經系統形成髓磷脂，可以支持周圍神經系統和中樞神經系統神經再生，SCs移植促進神經損傷再生。有研究證實轉錄因子KLF7(Krüppel-like factor 7，KLF7)對軸突再生、神經元形態和存活具有重要調控作用[3-4]，課題組前期研究發現KLF7能夠顯著促進SCs增殖和遷移[5]。盡管KLF7轉染SCs能夠有效促進周圍神經損傷后功能重建，但如果供體SCs不是來自宿主動物，則可能導致免疫排斥。此外，SCs的分離、增殖、純化時間較長，在可能發生神經恢復的時間窗內難以獲取和擴增足以進行基于細胞治療的SCs數量[6]。另外，供體部位并發癥等困難也嚴重限制SCs的臨床應用[7]。骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)作為組織工程移植的種子細胞已得到廣泛研究，用于移植修復脊髓損傷、創傷性腦損傷和周圍神經損傷等疾病[8-9]。BMSCs作為神經再生的重要種子細胞，具有體外分離培養方便、自我增殖、增殖速度快特點，而且BMSCs是具有相對較低免疫原性的多潛能干細胞。其能夠分化為多種類型的細胞，如成骨細胞、脂肪細胞和內皮細胞。BMSCs在體內和體外也可分化為神經譜系，如神經元和星形膠質細胞，通過誘導劑可向施萬樣細胞分化[9]。盡管BMSCs移植能夠促進周圍神經的再生并減輕坐骨神經損傷，但BMSCs移植細胞仍存在問題，如BMSCs低活力、低分化率、歸巢和低存活率[8]。鑒于前期研究推測移植BMSCs結合轉錄因子KLF7可能為坐骨神經損傷的恢復提供一種新的治療選擇[3]。但目前關于KLF7對BMSCs的作用尚未見報道。最近研究表明，BMSCs分泌細胞外囊泡含有KLF7 mRNA及其他多種轉錄因子，BMSCs能夠通過分泌轉錄因子影響自身增殖和分化過程[10]。基于上述原因，本研究擬通過AAV-KLF7腺病毒轉染BMSCs，探討KLF7對BMSCs增殖和施萬樣細胞分化的作用及其機制，為臨床周圍神經損傷修復提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1．1實驗動物和試劑Sprague Dawley(S-D)大鼠6只[哈爾濱醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)203-001]。AAV2-KLF7病毒、AAV2-NC病毒(美國abm公司)；兔抗大鼠KLF7抗體、兔抗大鼠S100抗體、CD29、CD90、CD34、CD45單克隆抗體(均購自美國Sigma公司)；KLF7、NGF和GAPDH引物(寶泰克生物科技公司合成)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM/F12培養基、胰蛋白酶、DAPI、β-巰基乙醇、全反式維甲酸、毛喉素、重組人heregulin-β1、堿性成纖維細胞生長因子、大鼠血小板衍生生長因子AB(均購自美國Sigma公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑盒(德國寶靈曼公司)；qRT-PCR試劑盒(購自武漢博士德公司)。

1．2BMSCs培養在無菌條件下分離成年大鼠雙側股骨、脛骨，剪斷兩端，用DMEM/F12培養基沖洗骨髓腔3～5次，將沖洗出骨髓細胞懸液離心，去除上清液。選用10%胎牛血清的DMEM/F12培養基混勻細胞，在培養皿中培養48 h去除非貼壁細胞，貼壁細胞標記為第0代(P0)。每3 d更換一次培養基，貼壁細胞生長密度達到85%后用胰蛋白酶消化傳代，第4代細胞鋪板并用于所有實驗[11]。細胞免疫熒光染色檢測CD29、CD90、CD34、CD45表面抗原，鑒定BMSCs。

1．3病毒轉染和細胞分組BMSCs接種于6孔板(2×107細胞/孔)中，當細胞培養至90%融合進行轉染。將AAV-NC和AAV-KLF7(6.5×109病毒顆粒/mL，150 μL/孔)轉染12 h。3 d后替換為新鮮培養基。穩定轉染BMSCs細胞分為正常組(未加入病毒)、AAV-NC組和AAV-KLF7組。

1．4Western bolt轉染培養3 d后將每組BMSCs樣品勻漿。SDS-PAGE電泳，上樣量為20 μg蛋白/孔。電泳結束后轉到PVDF膜上。在4 ℃下用一抗KLF7(1∶500)孵育過夜。次日洗膜后與HRP標記二抗在室溫下孵育1 h(1∶5 000)。GAPDH設定為內參。PBST洗膜后用ECL試劑盒顯色。

1．5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)將每組BMSCs樣品在病毒轉染后3 d進行勻漿。按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并將提純的RNA稀釋至500 ng/μL。qRT-PCR按照 PrimeScript?RT試劑盒說明操作。β-actin設為內參，用于實時熒光定量PCR(RT-PCR)的引物序列：KLF7上游5'-TTTCCTGGCAGTCATCTGCAC-3'，下游5'-GGGTCTGTTTGTTTGTCAGTCTGTC-3'；NGF上游5'-ACCTCTTCGGACACTCTGGA-3'，下游5'-GTCCGTGGCTGTGGTCTTAT-3'；β-actin上游5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。使用2-△△CT法計算基因表達水平。

1．6MTT法各組細胞以每孔1.25×103細胞的密度接種在96孔板中，在完全培養基中培養1、2、4、6和8 d。每24 h更換一次新鮮培養基。在各時間點使用MTT評估細胞增殖情況。

1．7EdU細胞免疫染色轉染8 d將細胞與EdU培養4 h標記增殖細胞。根據說明書用Cell-LightTMEdU DNA細胞增殖試劑盒對行EdU免疫染色。從5個區域中計數EdU陽性率=EdU陽性核數/DAPI陽性核數。

1．8BMSCs分化為施萬細胞樣細胞將3組細胞放入有1 mmol/L β-巰基乙醇無血清DMEM中培養24 h。然后用10%胎牛血清和35 ng/mL全反式維甲酸替換培養基培養3 d。應用誘導培養基培養培養10 d。誘導培養基包括DMEM、10% FBS、5 μmol/L毛喉素、200 ng/mL重組人heregulin-β1、10 ng/mL性成纖維細胞生長因子和大鼠血小板衍生生長因子AB[12]。用0.25%的胰蛋白酶消化收集各組分化細胞。將細胞以105個細胞/mL密度接種到蓋玻片上進行細胞免疫熒光染色，4 ℃下應用一抗S-100(1∶200)和DAPI(1∶200)孵育過夜。洗滌后熒光山羊抗兔IgG(FITC)(1∶200)孵育1 h，使用Olympus BX41熒光顯微鏡觀察，計數S100陽性細胞比率。

2 結果

2．1BMSCs形態和表型在倒置顯微鏡下觀察到第1、2和4代培養細胞形態與同代BMSCs細胞形態一致(圖1A)。BMSCs中CD29和CD90陽性表達(圖1B、C)，而CD34和CD45陰性表達(圖1D、E)。

圖1 BMSCs形態和表型特征 A：第1、2和4代的BMSCs；B～E：CD29、CD90、CD34或CD45(綠色)進行BMSCs免疫熒光染色，并進行細胞核染色(DAPI；藍色)；標尺=100 μmFigure 1 Morphology and phenotype characterization of BMSCs.A：BMSCs at passage 1，2，and 4.B-E：Immunohistochemical labeling of BMSCs by CD29，CD90，CD34，or CD45 (green) with nuclear staining (DAPI；blue).Scale bars：100 μm

2．2KLF7促進BMSCs中KLF7和NGF表達與正常組和AAV-NC組比較，AAV-KLF7組中KLF7蛋白和mRNA表達顯著升高 (蛋白：F2，6=91.31，P<0.001；mRNA，F2，15=46.88，P<0.001)(圖2A、B)。AAV-KLF7組中NGF mRNA的表達也顯著增高(F2，15=16，P<0.01)(圖2C)，正常組與AAV-NC組細胞KLF7和NGF mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組細胞中KLF7和NGF表達 A：培養3 d后，Western bolt檢測3組細胞中KLF7蛋白相對表達(n=3)；B～C：qRT-PCR檢測各組細胞中KLF7和NGF mRNA的相對表達(n=3)；**P<0.01，***P<0.001；NS：無顯著差異Figure 2 Efficacy of in vitro AAV-KLF7 gene transfer to BMSCs.A：Representative Western blots of KLF7 expression in the three groups of cultured BMSCs are shown at 3 days in vitro (n=3)；B-C：qRT-PCR revealed the relative expression of KLF7 and NGF mRNA in the three treatment groups of BMSCs at 3 days in vitro (n=3)；**P<0.01，***P<0.001；NS：not significant

2．3KLF7促進BMSCs體外增殖轉染8 d，與正常組和AAV-NC組相比，AAV-KLF7組BMSCs的EdU陽性細胞比率顯著增多(F2，15=40.95，P<0.001)(圖3A、B)，MTT結果顯示，第8天與正常組和AAV-NC組相比，AAV-KLF7組BMSCs增殖活性顯著增加(F2，15=40.95，P<0.001)(圖3C)。

圖3 KLF7促進BMSCs體外增殖 A：DAPI(藍色) 標記細胞總數，EdU(紅色)標記增殖BMSCs數量；B：檢測各組細胞EDU陽性細胞比率；C：各組細胞培養1、2、4、6、8 d，MTT法檢測細胞增殖情況；**P<0.01，***P<0.001；NS：無顯著差異；標尺=100 μmFigure 3 KLF7 promote BMSCs proliferation in vitro A：The total number of the cells shown by DAPI (blue) staining，the number of proliferating BMSCs was determined through EdU (red) staining；B：EdU labeling index of each group；C：Each group BMSCs were incubated for days 1，2，4，6，or 8.Cell proliferation was assessed by MTT assay；**P<0.01，***P<0.001；NS：not significant；Scale bars=100 μm

2．4AAV-KLF7促進BMSCs施萬樣細胞分化誘導10 d后BMSCs與SCs細胞形態相似，呈狹窄梭狀樣形狀(圖4A)。AAV-KLF7組S100陽性細胞比率顯著高于正常組和AAV-NC組(F2，15=16.68，P<0.05)(圖4A、B)。正常組與AAV-NC組S100陽性細胞比率無顯著差異(P>0.05)。

圖4 KLF7促進BMSCs施萬樣細胞分化 A：誘導8 d各組BMSCs表現出與SCs相似的形態，呈狹窄梭狀樣形狀，免疫熒光顯示S100陽性細胞標記為綠色，細胞核標記為藍色(DAPI)；B：計數S100陽性細胞比率(n=3)；***P<0.001；NS：無顯著差異；標尺=100 μmFigure 4 KLF7 improves Schwann-like cell differentiation of BMSCs.A：In the photomicrographs，each group BMSCs showed similar morphology to SCs by day 8，presenting a narrow fusiform-like shape.Immunofluorescence images show S100+ cells labeled in green，and cell nuclei labeled in blue.B：Graphs represent that quantification and analysis of the ratio of S100+ cells.n=3，***P<0.001.NS：not significant.Scale bars=100 μm

3 討論

全世界每年有100萬人受到周圍神經損傷(PNI)的影響。在歐洲有近30萬例PNI創傷病例。美國PNI占所有創傷患者的3%，如果考慮到神經叢和根部撕脫，PNI發病率會增加到5%。神經端端縫合用于治療簡單神經橫斷，但在大多數情況下由于神經近端和遠端殘端之間距離較大，因此無法進行簡單的縫合[13]，自體神經移植是這類PNI的金標準治療方法。自體神經提供一個物理和生物學支架用于誘導軸突穿過缺損區域生長，重建神經連續性，但自體神經移植存在許多技術限制，如供體來源有限、二次手術引起的并發癥以及神經瘤形成疼痛的風險。組織工程技術是當前治療PNI的新策略。組織工程化神經移植物的組成包括支架材料、種子細胞和神經營養因子，其中組織工程神經移植的種子細胞SCs能夠介導軸突損傷的再生和髓鞘再生，分泌胰島素樣生長因子-1、神經營養因子和腦源性神經營養因子等多種神經營養成分，促使周圍神經系統較中樞神經系統具有更好的自我恢復能力[4-5]。臨床應用中SCs在分離、增殖和純化以及供體部位并發癥方面面臨困難，而且殘留的成纖維細胞在SCs培養過程中仍然保留，且增殖快于SCs。如果將SCs與大量成纖維細胞一起移植，則會形成瘢痕[6]，而且在嚴重受傷的情況下，SCs數量仍無法達到完全神經再生水平，因此迫切需要具有廣泛自我更新能力、分化潛力、低免疫原性和易于獲得等特性的種子細胞來源。

BMSCs由于其可及性、快速增殖、弱免疫原性和神經分化可塑性而成為周圍神經再生最有希望的種子細胞之一。大量實驗研究表明BMSCs在周圍神經損傷再生和修復中具有有益作用。盡管機制尚不清楚，但它應至少包括以下4個方面[14-16]：(1)BMSCs能夠分泌營養因子和支持物質，如NGF、腦源性神經營養因子、神經膠質細胞源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白，增強體內神經營養性微環境，促進受損神經修復；(2)通過旁分泌信號調節炎癥；(3)激活宿主干細胞促進組織修復；(4)BMSCs是源自中胚層中自我更新的多能成年前體細胞，具有分化為中胚層譜系細胞的能力，具有多向分化的特征，能夠分化為SCs。在周圍神經損傷中BMSCs能夠作為SCs的替代細胞，一部分移植BMSCs分化為SCs，促進周圍神經再生和功能恢復，但移植的BMSCs在神經移植物中存活率和SCs分化率非常低。大量研究證實[6]，BMSCs植入神經移植物可有效促進軸突再生并改善神經功能恢復，其有效作用基于BMSCs在神經移植物中的長期存活。但由于存活率低和SCs分化效率低，移植BMSCs表現不佳。研究表明植入坐骨神經至少存活33 d，但只有5%的BMSCs分化為SCs，且大多數植入BMSCs保持未分化狀態[17]。

近年來研究發現[6]轉錄因子能夠參與調控BMSCs增殖和分化，KLF家族是一類具有鋅指結構的轉錄因子家族，其典型結構特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結構。KLF7調控多種細胞的發育、增殖和分化，對中樞神經系統軸突再生、髓鞘形成和神經膠質細胞的分化發揮重要作用[18]。前期研究發現，通過修飾SCs過表達KLF7能夠增強坐骨神經橫斷損傷后脫細胞神經移植物的移植和天然施萬細胞的增殖。這種反應顯著促進ANA中軸突再生和髓鞘再生增強，以及神經肌肉神經支配和功能恢復增加[5]，但用于種子細胞治療的SCs受到獲取時間較長和供體部位并發癥限制[6]。目前尚不清楚KLF7對BMSCs細胞表型和分化的影響。

本研究在體外培養擴增BMSCs，通過CD29、CD90、CD34和CD45驗證了BMSCs純度，將KLF7基因通過腺相關病毒轉染至BMSCs中，使其有效表達目的基因，結果表明AAV-KLF7能夠有效轉染BMSCs，顯著促進KLF7蛋白和mRNA表達。同時本研究發現AAV-KLF7亦能顯著促進NGF表達，NGF是KLF7的主要靶基因之一。NGF可以保護神經元、促使SCs增殖、引導軸突生長，由此可見在NGF修復周圍神經損傷中起到重要的作用[19]。因此本研究推測，NGF可能是KLF7作用BMSCs的一個重要作用機制。

前期研究[5]證明KLF7表達能夠促進SCs分泌NGF，促進SCs增殖和遷移，抑制SCs凋亡，對SCs具有顯著保護作用，推測本研究中KLF7過表達對BMSCs具有同樣作用。為證實這一假說，通過細胞增殖和誘導分化實驗發現，與正常組和AAV-NC組比較，AAV-KLF7組EdU標記細胞數量顯著增多，表明KLF7過表達促進BMSCs增殖。MTT檢測結果也證實這一觀點。在檢測KLF7對BMSCs誘導分化實驗中發現AAV-KLF7組的S100陽性細胞比率高于兩個對照組，表明KLF7能夠顯著促進BMSCs施萬樣細胞分化。

本研究探討并證實體外KLF7增強BMSCs增殖和施萬樣細胞分化，其機制可能與上調NGF信號通路有關。以KLF7轉染的BMSCs為種子細胞有望成為促進組織工程神經再生的重要方法之一。