蛋白質含量測定和SDS-PAGE指紋圖譜的建立在乳制品營養價值研判中的應用

秦貝樂 鄒昀珊 徐卓楠

摘 要：隨著生活水平的提高，人們對乳制品的需求量越來越大。但普通消費者不了解其中營養蛋白的成分，無法區分不同乳制品的優劣。本研究通過紫外分光光度法和考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，比較不同乳制品中蛋白質含量，同時使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），分析和鑒定其中的血清血蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，研判不同乳制品中蛋白含量高低和種類多少，建立蛋白質含量測定法和SDS-PAGE指紋圖譜，從而判斷乳制品營養價值。

關鍵詞：乳制品;蛋白質濃度;蛋白質種類;考馬斯亮藍;SDS-PAGE

1.背景

乳制品營養豐富，市場廣闊，受到各年齡段人們的歡迎，且人們對其營養成分及哪種乳制品最具營養價值感到好奇。本研究將從此現象出發，用科學方法（即用于蛋白質含量測定的考馬斯亮藍法及紫外分光光度法和用于蛋白質類型分析與鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳法）研判這六種乳制品的蛋白質含量高低和種類多少，從而建立蛋白質含量測定方法和SDS-PAGE指紋圖譜，來判斷乳制品營養價值，從而獲得乳制品的營養價值信息。

據調查顯示，現有研究僅使用一種方法（例如：直接電位法，甲醛滴定法等）進行研究，而該小組使用多種方法確定蛋白質含量。以上方法易于理解，結果直觀，應用價值高。其次，研究目的不同。此前研究僅關注確定乳制品蛋白質含量的方法，而本研究從科學的角度出發選擇大量乳制品樣品進行研究。

根據日常生活中常見的乳制品類型進行抽樣調查[4]，定量研究市場上某品牌乳制品的中有機鮮牛乳，生牛乳，發酵乳（酸奶），鮮牛乳，脫脂鮮牛乳以及風味發酵乳 （藍莓味酸奶）中蛋白質含量，定性分析它們是否都含有血清血蛋白、酪蛋白（包含β-酪蛋白和α-酪蛋白）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。

2.方法

2.1考馬斯亮藍法

將考馬斯亮藍G-250與不同濃度蛋白溶液（0.1mg/ml，0.2mg/ml， 0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml）混合并加入比色杯3/4處。測吸光度并繪制蛋白質濃度標準曲線。 重復測3次（樣品配置：將1-6號牛奶分別稀釋5倍、10倍和100倍），取各組平均值。

2.2 A280紫外可見分光光度法（UV-VIS法）

依次將10倍稀釋的乳制品溶液1-6添加到比色杯中，并用UV分光光度計測量吸光度（重復測3次，取平均值）。

2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE）

將分離凝膠添加到TEMED中，混合注入玻璃板間隙中，再添加正丁醇。聚合結束后，除去液體，用去離子水洗滌凝膠上部，剩余液體用吸收紙干燥。將5ml5%濃縮凝膠插入梳子后，室溫下垂直放置。當聚合時，將添加緩沖液的樣品加熱縮聚后，用去離子水沖洗凝膠，放入電泳槽中。混合10μL溴酚藍分別稀釋10倍和100倍。將1-6組乳制品注入并電泳，直到染料到達分離凝膠的底部。使用溶于乙醇，濃度為0.1%（W/V）的考馬斯亮藍R-250對瓊脂進行染色和浸泡;加入10%（V/V）的乙醇和7.5%（V/V）的乙酸浸泡瓊脂并反復洗滌以完成脫色。

3.1 標準曲線分析

考馬斯亮藍法測定A595nm處的吸光度并繪制標準曲線（如圖1），得出R2 = 0.9788的擬合曲線。測量280nm處的吸光度并繪制標準曲線（如圖2），得出R2 = 0.999的擬合曲線。0.9788和0.9999都接近1，因此可用于計算乳制品中的蛋白質含量。

3.2 不同乳制品中的蛋白質含量分析

如表1所示，將樣品分別稀釋5倍、10倍、100倍，在A595nm處測其吸光度，根據考馬斯亮藍法測的標準曲線算出每種乳制品的蛋白質含量。#1有機鮮乳制品，#2生牛乳，#4鮮乳制品，#5脫脂鮮乳制品分別稀釋100倍，吸光度分別為0.585、0.935、0.515、0.205，#3發酵乳稀釋10倍后吸光度為0.634。計算可得各種類乳制品蛋白質含量為：#1有機鮮乳制品10-20 mg/mL， #2 生牛乳大于100mg/mL; #3 發酵乳（酸奶）1-2 mg / mL; #4鮮乳制品10-20mg/mL。

如圖3所示，稀釋10倍的乳制品樣品在A280nm處進行測定。10倍稀釋后，#1，#2，#4和#5中測得的可溶性蛋白質含量更高。從高到低稀釋10倍后，六種乳制品的蛋白質含量從低到高分別為：脫脂鮮乳制品、鮮乳制品、有機鮮乳制品和生牛乳。

3.3不同乳制品中蛋白質種類的分析

從圖4中六種類型乳制品的SDS-PAGE分析和已知蛋白質成分比較（表2）可看出，除了#6所有乳制品都包含相似量的β-酪蛋白和α -酪蛋白，但從表3中可看出，#1、#2和#4β-乳球蛋白和α-乳白蛋白含量更高。α-乳清蛋白含有人體必需的大量氨基酸，例如人體必需卻不能人體合成的亮氨酸和異亮氨酸。盡管所有含蛋白質的食物都含有這些，但可以看出新鮮的乳制品含量更加豐富。

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4.結論

六種乳制品中蛋白質含量最高的是#2生牛乳，其濃度超過100 mg / mL，其次是#5脫脂鮮乳制品，然后是#4鮮乳制品和#1有機鮮乳制品。#1有機鮮乳制品蛋白質種類最豐富（包括血清蛋白，酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白），其次是#2生牛乳和#4鮮乳制品。最后是兩種風味的#3和#6發酵乳（幾乎不含蛋白質）。