丹酚酸A對TNF-α誘導的 人腎小球系膜細胞增殖的作用及機制研究

王增陽，徐 浩，鄭 濤，劉中信，徐佳慧，范華英*

（煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協同創新中心、 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室（煙臺大學），山東 煙臺 264005）

狼瘡性腎炎（Lupus Nephritis，LN）是一種由系統性紅斑狼瘡引起的自身免疫性疾病。腎小球系膜細胞的過度增殖是LN中最嚴重的病理表現之一[1]。長正五聚體蛋白3（Pentraxin 3，PTX3）與LN的發病相關，在LN患者的血清中表達升高[2]。目前臨床上治療LN的藥物仍會引起嚴重的毒副作用，因此尋找新的治療藥物是目前亟待解決的問題。丹酚酸A提取自丹參，具有良好的抗炎抗氧化和免疫調節作用[3]。本研究通過TNF-α誘導系膜細胞過度增殖，檢測丹酚酸A對系膜細胞過度增殖的影響，并初步評價其作用機制。

1 材料與試劑

腎小球系膜細胞購自中科院上海細胞庫（BNCC341134）。丹酚酸A由山東靶點藥物研究有限公司提供。TNF-α購自Sigma公司。MTT購自碧云天生物技術研究所。PTX3 ELISA試劑盒購自R＆D Systems。NF-κB p65，IκBα抗體購自Santa Cruz Biotechnology Inc。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測丹酚酸A對TNF-α誘導的腎小球系膜細胞過度增殖的影響

以每孔8000個細胞接種于96孔板，設置對照組、TNF-α組、TNF-α＋不同濃度丹酚酸A干預組。除正常組外，其他各組均加入TNF-α（10 ng/mL），在24 h后加入不同濃度的丹酚酸A培養24小時，每組設置三個復孔。加入MTT溶液（濃度為5 mg/mL）孵育4 h。去除上清，再加入150 μL DMSO溶解甲瓚。在波長為570 nm處測量吸光度，計算細胞存活率。

2.2 ELISA法檢測丹酚酸A對TNF-α誘導的PTX3表達的影響

按上述分組處理細胞，收集上清液，根據PTX3酶聯免疫分析試劑盒說明書檢測PTX3的表達情況。

2.3 Western-Blot法檢測丹酚酸A對NF-κB信號通路相關蛋白表達水平

按上述分組處理細胞后提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，然后進行聚丙烯凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂奶粉封閉，用TBST洗膜后孵育一抗4℃過夜。TBST洗膜后孵育二抗室溫孵育，顯影檢測蛋白條帶。

3 實驗結果

3.1 丹酚酸A顯著抑制腎小球系膜細胞的過度增殖

MTT檢測結果如表1所示。結果表明丹酚酸A不同濃度組呈劑量依賴性抑制系膜細胞增殖。

表1 丹酚酸A對TNF-α誘導的腎小球系膜細胞過度增殖的抑制作用

3.2 丹酚酸A對TNF-α誘導的PTX3表達的影響

ELISA結果如圖1所示，丹酚酸A能夠在一定程度上抑制PTX3的表達，且丹酚酸A 100μM組（P＜0.01）對PTX3表達的抑制效果明顯優于其他兩組。

圖1 丹酚酸A對TNF-α誘導的PTX3表達的影響

3.3 丹酚酸A對NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的影響

Western Blot結果如圖2所示，與TNF-α組相比，不同濃度丹酚酸A組均可抑制p65的蛋白表達并且可以提高IκBα蛋白的表達，且具有顯著性差異。

圖2 丹酚酸A對NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的影響

4 討 論

LN發病機制比較復雜，腎小球系膜細胞異常增殖使LN的病理表現異常復雜[4]。PTX3產生于炎癥部位，參與炎癥反應及免疫系統的調節。在LN患者中，PTX3的過表達加重了腎損傷[5]。我們猜想丹酚酸A是否可以通過抑制NF-κB信號通路的激活，從而抑制PTX3的表達。本研究結果表明丹酚酸A可以通過抑制系膜細胞的增殖以及NF-κB通路的激活抑制PTX3的表達，對腎臟具有一定的保護作用。