地衣芽孢桿菌ZSZ6高效降解羽毛產氨基酸條件的優化

周 影,魏啟舜,王 琳,郭成寶,趙荷娟,文蔚明

(江蘇丘陵地區南京農業科學研究所,江蘇 南京 210046)

氨基酸是構建生物有機體的眾多生物活性大分子之一,也是構建生物細胞、修復組織的基礎材料[1]。肥料中的游離氨基酸能夠被植物直接吸收利用,提高肥料利用率和作物養分的轉化率,促進作物生長,提高施肥對象的抗病性,改善施肥作物的品質等功能,對于植物的生長有著重要的意義[2-4]。目前生產中多采用發酵菜粕[5-6]、魚粉,酸解病死畜禽[7],酶解羽毛、血液等方法獲得氨基酸液體肥,這些方法成本高,存在二次污染等風險,不利于大面積推廣應用。

羽毛作為家禽飼養和屠宰工業的副產物,全球每年產量達數百萬t[8],但因缺乏有效實用的轉化利用手段,大部分被作為廢棄物直接丟棄[9]。家禽羽毛屬天然角蛋白質,其粗蛋白含量高達80%以上[10-11],是一種具有潛在應用價值的蛋白質,可成為動物所需的重要蛋白來源[12-13]。水解利用羽毛蛋白質生產復合氨基酸具有潛在的經濟效益[14]。

用傳統的酸堿水解和高壓蒸煮的方法處理農業廢棄物存在很多弊端,因此生物發酵方法成為首選。目前已發現30余種微生物可用于羽毛角蛋白的降解,主要包括細菌類的芽孢桿菌屬[15-16]、真菌類的曲霉屬[17]、放線菌的鏈霉菌屬[18]。然而目前用微生物降解羽毛大多以提高酶活、生產角蛋白酶為主要目的。而通過改進發酵工藝,以提高降解液中游離氨基酸含量為目的的研究鮮見報道。

我們利用本研究室前期篩選獲得的1株能有效降解羽毛的地衣芽孢桿菌ZSZ6液體發酵降解羽毛，探究了外加碳氮源、溫度、初始pH值、裝液量、羽毛量、 接種量等不同發酵條件對其降解羽毛產游離氨基酸的影響,以期提高產物中的氨基酸含量,為畜禽養殖和屠宰加工廢棄物的肥料化利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 地衣芽孢桿菌菌株由江蘇丘陵地區南京農業科學研究所微生物實驗室篩選、保存。

1.1.2 羽毛 從市場上收集。經去雜、自然風干后切成1～3 cm長，備用。

1.1.3 試驗培養基 種子培養基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高壓滅菌20 min。

基礎發酵培養基:磷酸二氫鉀1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離氨基酸含量的測定 采用茚三酮法(GB/TB 314─2002),并在此基礎上稍作修改。

1.2.2 羽毛降解率的測定 發酵液離心后倒掉上清液,殘渣經105 ℃烘干至恒重,計算降解率，計算公式為：羽毛降解率(%)=(底物羽毛干重-降解后殘渣干重)/底物羽毛干重×100。

1.2.3 外加碳源對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入0.5%質量分數羽毛的基礎上,分別加入1%的乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉5種碳源,以不外加碳源為對照,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.4 外加氮源對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入0.5%質量分數羽毛的基礎上,分別加入1 g/L的硝酸鈉、酵母粉、硫酸銨、蛋白胨、尿素和牛肉膏6種氮源,以不外加氮源為對照,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.5 溫度對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入0.5%質量分數的羽毛,初始pH 7.2～7.4,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),分別在180 r/min+25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃條件下發酵培養72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.6 初始pH值對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入0.5%質量分數的羽毛,調節初始pH值分別為5、6、7、8、9,裝液量50 mL /250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.7 裝液量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入0.5%質量分數的羽毛,初始pH 7.0,設置裝液量分別為50、75、100、125、150 mL/250 mL三角瓶,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養72 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.8 底物羽毛量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 基礎發酵培養基初始pH 7.0,裝液量125 mL/250 mL三角瓶,分別添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%質量分數的羽毛,接種量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養96 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.9 接種量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 向基礎發酵培養基中加入5%質量分數的羽毛,初始pH 7.0,裝液量125 mL/250 mL三角瓶,接種量設1%、2%、3%、4%、5%(v/v),在37 ℃、180 r/min條件下發酵培養96 h，然后測定游離氨基酸的含量。

1.2.10 降解時間對羽毛發酵產游離氨基酸的影響 按優化后的工藝(培養基初始pH值7.0,裝液量125 mL/250 mL,底物羽毛量5%質量分數,接種量2%體積分數,發酵溫度37 ℃,離心轉速180 r/min)進行羽毛發酵培養,連續培養12 d,每天取樣測定樣品中的游離氨基酸含量,并測定羽毛降解率。

1.3 數據分析

應用Excel 1997-2003和SPSS 19軟件進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 外加碳、氮源對降解羽毛產游離氨基酸的影響

有研究表明,外加碳、氮源能夠補充營養物質,促進細菌生長。本研究結果(圖1、圖2)顯示,外加乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛產游離氨基酸均未產生促進作用,發酵液中游離氨基酸含量均低于純羽毛的對照。外加不同氮源的處理羽毛降解情況均差于純羽毛的對照；部分降解液中游離氨基酸含量高于對照，這可能是外加氮源在發酵過程中被菌體降解產生的。分析原因,外加碳、氮源有利于菌體的生長,相較于難以利用的羽毛,地衣芽孢桿菌會優先選擇利用外加營養物質，因而不產生角蛋白酶,從而影響了其對羽毛的降解,不利于游離氨基酸的產生。因此,對于地衣芽孢桿菌ZSZ6來說,培養基中外加碳、氮源并未能對其降解羽毛產氨基酸起到促進作用,其可以羽毛為唯一營養源而獲得較好的降解效果。

圖2 不同氮源對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

2.2 溫度對降解羽毛產游離氨基酸的影響

溫度是影響微生物生長及分泌代謝產物的重要影響因素。溫度過高或過低均不利于微生物的生長,進而影響羽毛降解效果[19]。本研究結果(圖3)表明,溫度對菌株降解效果的影響較為顯著。隨著降解溫度的升高,發酵液中游離氨基酸含量呈先增加后減少的趨勢。在25、30 ℃溫度下游離氨基酸含量均較低；當溫度升至35 ℃時，發酵液中游離氨基酸含量增加較多,達到1.15 g/L；當降解溫度為37 ℃時，游離氨基酸含量最高，達1.44 g/L,較35 ℃條件下提高了24.9%；當溫度升至40 ℃時，降解液中游離氨基酸含量則開始下降。上述結果說明,37 ℃的溫度可能是地衣芽孢桿菌ZSZ6的最適生長溫度,該溫度條件有利于菌體的生長,從而促進羽毛的降解,提高發酵液中游離氨基酸的含量。

圖3 溫度對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

2.3 初始pH值對降解羽毛產游離氨基酸的影響

本實驗設置5～9范圍的初始pH值,結果(圖4)顯示,發酵培養基過酸或過堿均不利于菌體的生長,當pH值為5時,發酵液中的游離氨基酸含量最低,僅為0.18 g/L,且羽毛降解效果最差；當pH值升至6時,氨基酸含量顯著增加,是pH 5時的4.9倍；當初始pH值為7時,產物中游離氨基酸含量最高,達1.02 g/L；在pH 8和pH 6條件下的氨基酸含量接近,但都小于pH 7下的；當pH值調節為9時,氨基酸含量降低明顯。表明,地衣芽孢桿菌ZSZ6適宜的生長pH值偏中性。

圖4 初始pH值對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

2.4 裝液量對降解羽毛產游離氨基酸的影響

裝液量的多少影響發酵液的溶氧量,對菌體的生長、代謝會產生一定的影響,直接影響到菌株的產酶活性和對羽毛角蛋白的降解,從而影響到發酵液中游離氨基酸的含量[20]。從圖5可以看出，隨著裝液量的增加，發酵液中游離氨基酸含量呈先增加后減少的趨勢。具體來說：當裝液量為50～125 mL時,隨著裝液量的增加,發酵液中游離氨基酸含量升高,在裝液量為125 mL時,發酵液中游離氨基酸含量達到最大值(1.05 g/L)；當裝液量增加到150 mL時,產物中游離氨基酸含量開始下降(0.95 g/L)；當裝液量達到150 mL時,培養液中總溶氧量減少，不能滿足好氧細菌對氧氣的需求,從而抑制了菌體的生長與代謝。在本實驗條件下,選用125 mL/250 mL的裝液量效果最佳。

圖5 裝液量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

2.5 羽毛添加量對游離氨基酸產量的影響

在本實驗條件下,羽毛作為地衣芽孢桿菌ZSZ6降解產游離氨基酸的唯一碳、氮來源,其含量多少對整個發酵過程至關重要。圖6顯示：當底物羽毛含量在0.5%～5%時，隨羽毛量的增加產物中游離氨基酸含量逐漸增多；當羽毛含量為5%時,氨基酸含量最高,達13.15 g/L；當繼續增加底物羽毛量至6%時,產生的游離氨基酸含量開始下降；當羽毛添加量增加到7%時,氨基酸含量下降明顯。這可能是由于羽毛量過多會影響料液比,發酵液溶氧量減少,不利于菌體生長,從而影響降解效果。同時,角蛋白酶是一種誘導酶,作為誘導物的羽毛含量對菌株的發酵產酶產生影響,但過量羽毛角蛋白添加會降低菌株產酶[21],不利于羽毛的降解。

2.6 接種量對羽毛降解效果的影響

圖6不同接種量的實驗結果表明：當接種量為1%～2%時,發酵液中的游離氨基酸含量隨接種量的增加而增大；當接種量為2%時，獲得的氨基酸含量最高,為12.15 g/L；在3%和5%的接種量產物中的游離氨基酸含量相近,且僅次于2%的處理；接種量為1%和4%時獲得的游離氨基酸含量相當,且較低。說明接種量對菌株代謝產生游離氨基酸的影響并非線性關系。綜合考慮降解效果和經濟效益,采用2%的接種量用于羽毛降解產游離氨基酸最為理想。

圖6 底物量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

圖7 接種量對羽毛發酵產游離氨基酸的影響

2.7 羽毛降解時間曲線

綜合上述優化的最佳發酵條件,連續發酵12 d,每天測定發酵產物中的游離氨基酸含量及羽毛降解情況。結果(圖8)顯示,降解液中的游離氨基酸含量呈現先增加后減少的趨勢。具體而言，在降解第2天，發酵液中的游離氨基酸含量迅速增加；在降解第2～5天為快速增長期,產物中的游離氨基酸含量迅速增加,且增幅較大，在發酵第5天時含量達到17.51 g/L；之后產物中的氨基酸含量增速放緩,到第9天達到峰值(19.47 g/L)后開始下降；在降解第12天時,游離氨基酸的含量為15.23 g/L,比高峰值減少了4.24 g/L。究其原因，可能是隨著時間的推移,微生物降解羽毛產生的氨基酸被用于自身的生長代謝[22],且消耗的速率大于羽毛降解產氨基酸的速率。

羽毛降解率隨發酵時間的增加而不斷升高。在發酵第5天降解率即達到70%以上；在發酵第12天降解率最高,為80.8%。由圖8可知：在發酵第1天僅有少量羽毛被降解；在第2天和第3天為快速降解期,羽毛降解速率最快；之后降解速率開始下降。分析原因，可能是隨著發酵時間的延長,ZSZ6降解羽毛產生高濃度的游離氨基酸及其它代謝產物,影響角蛋白酶的分泌及活性；同時,角蛋白酶的自身水解也直接影響了羽毛的降解[14]。

圖8 發酵時間對羽毛降解率及氨基酸含量的影響

3 結論與討論

隨著人們對環境保護的重視,利用生物方法處理角蛋白類廢棄物被越來越多的研究者關注。劉艷海等[23]研究發現,嗜熱性地衣芽孢桿菌Y6(BacilluslicheniformisY6)在最適發酵溫度55 ℃條件下72 h可降解除羽軸外的羽枝部分,所產蛋白酶為耐熱堿性蛋白酶;當解淀粉芽孢桿菌3-2以乳糖為外加碳源時發酵羽毛產氨基酸,可用于生產氨基酸復合肥料[14]；地衣芽孢桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221固體發酵廢棄羊毛產角蛋白產品,可用作飼料蛋白添加劑[24];地衣芽孢桿菌NJ-01用于分解鴿羽毛,37 ℃ 5 d鴿羽毛開始分解,在37 ℃下培養15 d時鴿羽毛小羽枝、羽毛梗全部分解為碎片[25]。

相較于前人的研究,本研究中地衣芽孢桿菌ZSZ6可有效降解羽毛廢棄物,且降解條件要求簡單,降解效率高,發酵可產生較高濃度的游離氨基酸。通過單因素試驗考察外加不同碳源和氮源、不同溫度、初始pH值、裝液量、底物羽毛量、接種量等對羽毛降解效果的影響，結果表明:在基礎發酵培養基初始pH值7.0、羽毛添加量5%、裝液量125 mL/250 mL、接種量2%、發酵溫度37 ℃條件下培養5～9 d,發酵液中游離氨基酸含量最高,達19.47 g/L。在優化條件下發酵5 d,產物中游離氨基酸含量即達17.51 g/L,羽毛降解率在70%以上。說明利用地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛可有效實現畜禽養殖廢棄物的資源化利用,產物可用于生產氨基酸產品。