三萜類化合物指紋圖譜在山茶油真偽鑒別研究

董瑩瑩，胡重怡，朱啟盛，朱作為，郭 平，張文中，王 棟*

(1.江西農業大學，江西 南昌 330045；2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001；3.江西齊云山油茶科技有限公司，江西 贛州 341000)

食用植物油是人們日常生活的必需品，不同植物油營養成分和成本不同導致售價不同，以低價植物油冒充或摻假高價植物油而造成食用油市場魚龍混雜。隨著人們生活水平的提高，人們對食用植物油的品質越來越重視，通過明確不同食用油之間營養成分的差異將對有效遏制摻假提供了新思路[1-4]。

目前，指紋圖譜分析技術憑借高靈敏度，高穩定性和低樣品損耗的優勢廣泛應用于食品和醫藥檢測、人類疾病診斷等領域[5-6]，常見指紋圖譜技術主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質譜法(MS)等。國內外已有眾多學者利用指紋圖譜技術分析植物油中多種營養成分[8]。吳衛國等[9]利用氣相色譜法-質譜聯用(GC-MS)技術，構建了5類植物油標準脂肪酸指紋圖譜，為食用油的產品質量控制和摻假檢測提供理論依據。Purcaro等[10]利用全二維氣相色譜-火焰離子化檢測/質譜檢測技術方法(GC×GC-FID/MS)，分析了植物油中甾醇、游離脂肪酸和蠟等次要特征成分，并利用指紋圖譜技術準確判斷出特級初榨橄欖油中摻雜少量葵花籽油和棕櫚油的特征標志物。Roberta等研究橄欖油中摻雜不同比例的大豆油，利用ESI-MS得到大豆油中特有脂質標記物，從而迅速準確地判斷出橄欖油中摻假大豆油的比例[11]。三萜類化合物是食用植物油的重要脂肪伴隨物，又可細分為甾醇和三萜，本研究主要以特色高價食用植物油山茶油為材料，探究了幾種常見植物油并構建三萜類物質指紋圖譜，從而明確不同植物油之間三萜類化合物含量的差異，為今后山茶油真實性鑒別提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、稻米油、大豆油、亞麻籽油、山茶油各3種，購買于超市或由企業提供。

角鯊烯、膽甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇、環阿屯醇、無水吡啶由美國Sigma公司生產；羊毛甾醇由美國Avanti公司生產；中性氧化鋁由中國國藥集團生產，層析用，FCP200-300目、氫氧化鉀、無水乙醇由中國國藥集團生產，分析純；丙酮、正己烷由美國Honeywell公司生產，色譜純；0.22 μm有機濾膜由日本SHIMADZU公司生產；99∶1雙三甲基硅基三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷(99∶1，BSTFA-TMCS)由美國TCI公司生產。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-三重四級桿串接質譜聯用儀(7890B+7000D)(由美國安捷倫公司生產)；QUINTIX124-1CN電子分析天平(由德國賽多利斯公司生產，精度：≤0.1 mg)；HH-6電熱恒溫水浴鍋(由上海博訊實業有限公司生產)；Vortex Wizard渦旋儀(由意大利VELP公司生產)；N-EVAP氮吹儀(由美國Organomation公司生產)；R-100旋轉蒸發器(由瑞士Buchi公司生產)；層析柱、冷凝回流管、圓底燒瓶、玻璃試管(四川蜀玻有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 中性氧化鋁柱制備：根據GB/T 25223─2010/ISO 12228:1999《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[12]改進，在20 mL乙醇中加入10 g中性氧化鋁混合，并將混合液倒入層析柱中，使氧化鋁沉降并敲打至無縫隙，使用前打開活塞使乙醇液面到達氧化鋁頂層時關閉，備用。

植物油前處理：準確稱取0.5 g(±0.01 g)油樣，加入100 μL內標(1 mg/mL膽甾烷醇)和2%的氫氧化鉀-乙醇溶液10 mL，混勻，75 ℃下水浴回流1 h后冷卻至室溫，取5 mL皂化液過中性氧化鋁柱，先用5 mL乙醇活化后用30 mL正己烷洗脫不皂化物，收集洗脫液。洗脫液在65 ℃旋轉蒸發器蒸干后復溶于5 mL正己烷，轉移到15 mL玻璃離心小管中，氮吹干后加入100 μL硅烷化(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1500 μL正己烷稀釋后過0.22 μm有機濾膜，準備進樣。每個樣品3次重復。

標準品配置：用丙酮分別配置角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇1 mg/mL母液。其中膽甾烷醇為內標物，對其他10種目標化合物分別考察線性范圍。

根據不同植物油中目標化合物含量范圍，本試驗中標準曲線配置：用丙酮將母液稀釋，分別配置角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇1 mg/mL母液。根據不同植物油種類目標化合物實際含量，定量標準曲線配置：用母液分別配置成含有菜油甾醇(2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL)，菜籽甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇(1.25、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL)，角鯊烯、豆甾醇、β-谷甾醇(0.625、1.250、2.500、5.000、12.500、25.000 μg/mL)、膽固醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL)共6個梯度的混標，各梯度混標中加入100 μL內標(1 mg/mL膽甾烷醇)。氮吹后硅烷化衍生并用正己烷稀釋，備用。對目標化合物較高的樣品采取稀釋10倍后上機。

1.3.2 儀器分析條件

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣：氦氣，流速0.95 mL/min，進樣口溫度：320 ℃，進樣量為1 μL，不分流；柱溫升溫程序：初始溫度180 ℃，保持1 min，然后以4 ℃/min升到300 ℃，并保持25 min；溶劑延遲時間：20 min。

1.3.2.2 質譜條件 電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度300 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 50～650。

2 結果與分析

2.1 優化目標化合物分離條件

根據GB/T 25223─2010/ISO 12228:1999《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[12]方法改進，優化前處理和GC-MS條件，11個化合物標準品都能有效分離，結果見圖1。

2.2 GC-MS法檢測各食用油中三萜類化合物含量

角鯊烯是一種酚類活性成分，具有抗疲勞，提高機體免疫力和血紅蛋白攜氧能力，促進胃腸道吸收等功能，廣泛應用于保健品、藥品和化妝品等領域[13-16]；甾醇是以環戊烷多氫菲為骨架的一類甾體類化合物，它具有降低飲食中人體腸道對膽固醇的吸收，預防動脈粥樣硬化以及抗炎等功效[17-20]；三萜大多是由2,3-氧化鯊烯CCC構象環化而來，是植物油中的次要組成成分，具有預防心臟病、抗癌、抗氧化等功效，也可作為評估植物油質量和真實性的重要指標[21-22]。角鯊烯、甾醇、三萜都屬于萜類化合物，來自于植物甲羥戊酸代謝通路。

2.2.1 定性分析 在GC-MS全掃模式下對標準品進行掃描，并對各標準品線性范圍進行考察，各標準品線性范圍見表1，在線性范圍內線性關系良好。

2.2.2 定量分析 筆者根據前期對不同植物油的考察，再根據標準品線性范圍確定定量標準曲線，定量分析是采用內標法，根據標準物質峰面積等獲得被測組分含量，得到不同品牌的山茶油、稻米油、花生油、大豆油等8種食用植物油的三萜類化合物物質成分含量如表2所示，可以看出在幾種植物油中，花生油中角鯊烯含量最高，約為273.10 mg/kg，此結論與朱云[23]報道的花生油中角鯊烯含量218.33 mg/kg相當；菜籽甾醇在本試驗中只在菜籽油和稻米油中被檢測到，其中菜籽油含量高達1426.20 mg/kg；菜油甾醇在稻米油和菜籽油中的含量較高，遠遠高于其他植物油種類；豆甾醇在稻米油中含量最高，約為3274.61 mg/kg；羊毛甾醇和β-香樹脂醇只在山茶油中被檢測出來；β-谷甾醇在玉米油和菜籽油中含量較高；羽扇豆醇在稻米油中含量較高，約為663.94 mg/kg；環阿屯醇在亞麻籽油和山茶油中較高。從三萜化合物總量來看，稻米油、玉米油、菜籽油和山茶油均超過2000 mg/kg，富含三萜類化合物。

表2 各植物油中三萜類物質成分含量 mg/kg

2.3 主成分分析

利用PCA主成分分析對不同食用植物油的三萜化合物建模分析，發現不同植物油均可以按照植物油種類聚類在一起(圖2)。在所有聚類中，山茶油和稻米油與其他植物油種類可以明顯被分開，通過載荷圖可以看出，山茶油是由于香樹脂醇、環阿屯醇和羊毛甾醇較高而與其他植物油區分開來，在8種植物油中，其中羊毛甾醇和香樹脂醇只在山茶油中被檢出；稻米油則是由于較高的膽固醇、豆甾醇、菜油甾醇和羽扇豆醇與其他植物油區分開來；菜籽甾醇主要存在于菜籽油中，其他植物油中只稻米油檢測出少量。結合表2和圖2可以看出，在不同植物油中三萜類化合物指紋圖譜具有不同的特征，如稻米油中以β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇為主；花生油、大豆油、葵花籽油和玉米油以谷甾醇為主；而菜籽油中以菜籽甾醇、菜油甾醇和谷甾醇為主。

圖2 不同植物油三萜化合物PCA散點圖和載荷圖

從主成分分析結果可以看出，山茶油中β-香樹脂醇、環阿屯醇和羊毛甾醇屬于其特征三萜類化合物，可以作為對山茶油真偽的定性依據，而低價植物油中菜油甾醇含量均比山茶油高，因此今后可以作為山茶油中其他低價植物油摻假識別指標進行應用。

3 結論

山茶油營養豐富，富含角鯊烯、維生素E、植物甾醇，并且煙點較高，符合國人高溫烹飪飲食習慣，是我國有名的木本植物油。由于山茶油售價較高，不法商販常以低價油冒充山茶油摻假售賣，一直影響山茶油行業發展。對山茶油真偽鑒別中，國標方法利用山茶油高油酸含量的特點，通過脂肪酸含量判斷山茶油是否摻假，而目前市場上已經出現了新型高油酸花生油、高油酸葵花籽油、高油酸菜籽油，僅測定脂肪酸組成而往往不能滿足山茶油真偽鑒別的需求。本文通過對山茶油和常見食用植物油的三萜類物質進行檢測，并利用PCA主成分分析進行判別，我們發現三萜類化合物作為食用油中的一類重要的脂肪伴隨物，在不同植物油中種類和含量均有所差異；通過主成分分析，發現不同品種植物油均可依據三萜化合物含量和種類進行聚類，本方法可以為后續利用三萜化合物指紋圖譜對不同品種植物油鑒別起到借鑒作用。

綜上所述，本文利用GC-MS法測定8種植物油中的三萜類物質，建立了不同植物油品種三萜類化合物指紋圖譜同時應用PCA主成分分析，發現不同植物油中三萜化合物種類和含量有差異，山茶油中富含環阿屯醇、β-香樹脂醇和羊毛甾醇，其中β-香樹脂醇和羊毛甾醇是山茶油中特有的三萜化合物，可作為山茶油定性三萜化合物指標進行開發。此外針對幾種常見低價植物油，菜油甾醇含量均遠高于山茶油，后續可作為其他低價植物油摻假識別指標進行應用。