pH值、靜置、冷凍對不同種類蔬菜中丁硫克百威測定的影響

王 瑩,王世成,李 玲,林桂鳳,李國琛*

(1.中國科學院 沈陽應用生態研究所,遼寧 沈陽 110016;2.農業農村部 農產品質量安全環境因子風險評估實驗室(沈陽),遼寧 沈陽 110016)

丁硫克百威,化學名稱為2,3-二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃[(二丁基氨基)硫代]甲基氨基甲酸酯[1],是美國FMC公司開發的一種具有內吸性和高脂溶性、在土壤和植物中易于降解代謝的高效、廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲殺螨劑。這種克百威低毒化衍生物在昆蟲體內可轉化為更高毒性的克百威和3-羥基克百威[2]。自2017年8月1日起,我國撤銷了丁硫克百威在蔬菜上的農藥登記申請,自2019年8月1日起禁止在蔬菜上使用[3]。GB 2763─2019《食品安全國家標準：食品中農藥最大殘留限量》規定了蔬菜中丁硫克百威的最大殘留限量為0.05～1 mg/kg,但不包含其代謝產物[4]。

目前,蔬菜中丁硫克百威及其代謝物多采用液液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜凈化、加速溶劑萃取等[5-13]前處理手段進行提取和凈化,并結合氣相色譜法、氣質聯用法、液相色譜串聯質譜技術進行檢測[5-13]。楊爽等(2008)采用丙酮提取-液液分配凈化-氣質法檢測了辣椒中丁硫克百威及其代謝產物[8]；趙樺林等(2013)建立了白菜中硅藻土混合分散-加速溶劑萃取-固相萃取柱凈化-液相色譜串聯質譜檢測方法[9]；方宗壯等(2016)采用混合溶劑提取-弗羅里硅土凈化-氣質聯用法檢測了豇豆中丁硫克百威及其代謝物的殘留量[10]。上述方法均是對某一種類蔬菜基質進行檢測,而且未論述在前處理過程中丁硫克百威母體是否發生降解為克百威、3-羥基克百威的現象。因此,為了準確測定蔬菜中丁硫克百威母體的殘留量,我們對菜豆(果菜類)、結球甘藍(莖菜類)、蘿卜(根菜類)三種蔬菜基質經乙腈提取后,通過考察pH值、靜置時間、冷凍三因素,確定了最優的前處理方法，并與具有高靈敏度和選擇性的液相串聯質譜技術結合,建立了測定不同種類蔬菜中丁硫克百威殘留量的基質校正的UPLC-MS/MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器: 1250超高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access MAX三重串聯四級桿質譜儀、Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、T18數顯型高速分散機(德國IKA公司)、Vortex genius 3渦流振蕩器(德國IKA公司)、TD25-WS離心機(湖南湘儀公司)。

試劑:乙腈、氯化鈉、氫氧化鉀(均為分析純,天津康科德試劑公司);乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純,默克公司);超純水。

農藥標準品:丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威的100 mg/L標準溶液均購自農業部環境保護科研檢測所。

1.2 實驗方法

1.2.1 農藥標準工作溶液的配制 分別移取丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威的100 mg/L標準溶液各1 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成混合標準溶液10 mg/L。

蔬菜基質對分析過程易產生基質效應,影響分析結果的準確性[14]。為了消除基質效應的影響,采用空白樣品經過前處理后得到的溶液作為溶劑,將混合標準溶液分別稀釋成系列基質混合標準溶液,以待測物的質量濃度為橫坐標,定量離子對的色譜峰面積為縱坐標,繪制外標法曲線。

1.2.2 檢測條件 UPLC條件: T3柱(2.1 mm×150 mm,5 μm,美國Waters公司);柱溫35 ℃;流動相A為水;流動相B為甲醇。梯度洗脫程序:10% B保持1 min;在3.5 min內由10% B線性增加到95% B并保持1 min；隨后在3.5 min內線性回落到起始10% B并保持4 min；流速0.3 mL/min;進樣量5 μL。

MS/MS條件:電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;監測方式為多反應監測模式(MRM);噴霧電壓3500 V;蒸汽溫度300 ℃;離子傳輸管溫度270 ℃;鞘氣壓力25 arb;輔助氣壓力10 arb;碰撞能量、定性離子對、定量離子對見表1;色譜圖見圖1。

圖1 丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威(濃度均為50 μg/L)的MRM色譜圖

表1 丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威的質譜檢測條件

HRMS條件:電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;噴霧電壓3200 V;霧化溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃;鞘氣壓力40 arb;輔助氣壓力10 arb;監測模式為數據依賴性掃描(Full MS/dd-MS2),掃描范圍m/z 50～750, Full MS分辨率70000, dd-MS2分辨率17500;在MS/MS模式下,歸一化階梯碰撞能量為20%、40%、60%。

1.2.3 前處理方法 本實驗按照檢測時間分為3組(立即檢測組、靜置2 h檢測組、冷凍5 d檢測組),每組設2個處理(調pH值、不調pH值)和3個添加濃度(0.01、0.05、0.10 mg/kg)。具體分組見表2。

表2 前處理方法分組

稱取10.0 g樣品,向不調整pH值的樣品中加入10 mL水,向調整pH值的樣品中加入10 mL 0.025 mol/L KOH溶液,渦旋混勻。立即檢測組:迅速加入20 mL乙腈,以12000 r/min高速勻漿2 min；再加入7 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min；然后以5000 r/min離心5 min；最后取1 mL上清液,過0.22 μm膜,進行測定。靜置2 h檢測組:在調整或不調整pH值后,密封，在室溫下靜置2 h，然后按照立即檢測組的方法進行前處理。冷凍5 d檢測組:在調整或不調整pH值后,于-18 ℃密封冷凍5 d,然后取出解凍,按照立即檢測組的方法進行前處理。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的選擇

采用UPLC-MS/MS常用流動相甲醇+0.1%甲酸(v+v,1+1)配制丁硫克百威標準溶液,放置10 min、2 h、6 h、10 h、14 h、18 h后分別進行UPLC-MS/MS檢測,結果發現丁硫克百威在酸性條件下2 h內已經降解76.5%,4 h即達到91.7%。主要是因為丁硫克百威的N-S鍵在酸性條件下容易斷裂,轉化成克百威等降解產物[2]。因此檢測丁硫克百威,在配制標液、前處理以及上機檢測時,均建議不加酸。

采用標準溶液蠕動泵注射全掃描方式確定丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威均以[M+H]+為母離子,再對母離子進行二級碰撞能量優化,建立了MRM模式的最佳質譜條件(表1)。同時,對乙腈-水、甲醇-水兩種流動相條件下3種農藥的色譜峰面積進行比較，結果發現：甲醇-水流動相測得的3種農藥的峰面積較高,是乙腈-水流動相的1.3～7.8倍。所以本次實驗采用甲醇-水作為流動相。

2.2 丁硫克百威在酸性條件下的降解產物

將甲醇與0.1%甲酸水以體積比1∶1混合,配制1 mg/L丁硫克百威標液,于4 ℃避光條件下放置18 h后,采用UPLC-HRMS進行正離子模式Full MS/dd-MS2掃描。

丁硫克百威的分子式為C20H32N2O3S,理論分子量為380.22064,在ESI正離子模式下形成準分子離子峰C20H33N2O3S+,質量數為381.22064。它在酸性條件下不穩定,N-S鍵易斷裂,形成不同碎片離子(圖2),包括克百威(分子式C12H15NO3)的準分子離子峰C12H16NO3+,但未見3-羥基克百威(分子式為C12H15NO4)的準分子離子峰C12H16NO4+(238.10738)。由此可推斷在酸性條件下,丁硫克百威可降解為克百威,但不生成3-羥基克百威。

圖2 丁硫克百威在酸性條件下的降解產物

2.3 pH值、靜置、冷凍時間對丁硫克百威回收率的影響

從2.1、2.2部分的實驗結果可以看出,在酸性條件下丁硫克百威不穩定,回收率會降低。所以本次實驗選取3種不同蔬菜品種,包括菜豆(果菜類)、結球甘藍(莖菜類)、蘿卜(根菜類),在提取過程中進行了加水、加堿液的回收率比較。

由圖3a可以看出：在不調pH值的條件下,菜豆3個處理組的回收率為63.3%～130.0%;在調pH值的條件下,立即檢測組與靜置2 h檢測組的回收率與不調pH值沒有較大差異,而冷凍5 d后檢測的0.01 mg/kg、0.05 mg/kg的回收率已經下降到0%。由圖3b可以看出：結球甘藍調pH后回收率基本都優于不調pH的,其中立即檢測組調pH后3個濃度的回收率分別是83.6%、86.7%、110.0%,高于靜置2 h組、冷凍5 d組的。由圖3c可以看出：調pH對蘿卜的前處理影響最明顯;不調pH,僅立即檢測組0.1 mg/kg的回收率是64.7%,其余處理為0%～2.8%;調pH立即檢測組3個添加濃度的回收率均較高,分別是85.1%、91.7%、99.3%。總體來說,是否調pH和靜置2 h對菜豆的檢測基本上沒有影響；菜豆樣品勻漿后,加入水或堿液立即檢測或靜置2 h檢測均可。對于結球甘藍和蘿卜,不調pH、調pH靜置2 h和冷凍5 d都會降低回收率。綜上所述,對于3個不同種類蔬菜，先加入0.025 mol/L KOH溶液10 mL,再加入乙腈高速勻漿離心,在鹽析振蕩后立即檢測是最優方法。

圖3 在3種蔬菜基質中不同前處理方法的丁硫克百威回收率

2.4 在前處理過程中丁硫克百威的降解產物

實驗結果也表明,菜豆、結球甘藍、蘿卜在不調pH情況下,丁硫克百威的降解量隨時間增加而增多,而且添加樣品中都有克百威檢出,但未檢出3-羥基克百威(≤0.001 mg/kg);蘿卜中丁硫克百威的降解速度明顯快于菜豆和結球甘藍中的,部分丁硫克百威剛加入就直接分解。在調pH值處理中,樣品處于較強的堿性環境中,丁硫克百威在3種基質中的降解速度都有一定程度的減緩,但隨著靜置時間增加或冷凍,其含量也會逐漸降低,但均未檢出克百威(≤0.001 mg/kg)和3-羥基克百威(≤0.001 mg/kg)。根據上述現象可以推斷：當待測樣品處于酸性環境中時,丁硫克百威易降解并產生代謝產物克百威;在待測樣品中加入適量的堿液,調節樣品基質到中性或弱堿性時,可以降低其降解速度且不產生代謝產物克百威和3-羥基克百威。

因此,基于丁硫克百威在酸堿性條件下的分解特性,為了準確測定蔬菜中丁硫克百威母體,確保在前處理過程中不生成代謝產物克百威和3-羥基克百威,本研究采用2.3中確定的加入0.025 mol/L KOH溶液、用乙腈勻漿提取、立即檢測的前處理方法。在陰性蔬菜樣品中添加0.01、0.05、0.10 mg/kg三個濃度水平,每個濃度設6個平行，進行驗證實驗。結果表明,3個濃度添加水平均未檢出克百威(<0.001 mg/kg)和3-羥基克百威(<0.001 mg/kg)。因此,2.3中確定的前處理方法是最優的丁硫克百威母體的前處理方法。

2.5 分析方法的靈敏度、精密度與準確度

用蔬菜空白基質配制1、5、10、25、50、100、200 μg/L的系列標準溶液,在優化的檢測條件下上機測定。實驗結果表明丁硫克百威在1～200 μg/L范圍內線性關系良好,線性方程為Y=-94313.3+4599370X,相關系數R為0.9991。按照2.3中確定的前處理方法,在陰性蔬菜樣品中分別添加丁硫克百威 0.01、0.05、0.10 mg/kg三個濃度,每個濃度設6個平行,同時做空白實驗,均在扣除本底后計算回收率和相對標準偏差;分別以3倍和10倍信噪比對應的添加濃度作為檢出限和定量限。實驗結果表明：丁硫克百威在3種蔬菜中的檢出限為0.001 mg/kg,定量限為0.005 mg/kg,添加回收率為83.6%～115.4%, RSD為3.2%～9.1%(表3)。因此，該方法的精密度與準確度均符合痕量分析要求。

表3 在3種蔬菜中丁硫克百威的檢出限、定量限、回收率和相對標準偏差

3 結論

通過對菜豆、結球甘藍、蘿卜三種不同蔬菜基質前處理過程中調節pH值、靜置、冷凍條件的實驗結果進行比較,最終確定在樣品中加入0.025 mol/L KOH溶液渦旋混勻,加入乙腈高速勻漿,鹽析并離心,取上清液立即進行檢測是丁硫克百威母體的最優前處理方法。同時,確定了最佳的超高效液相色譜-串聯質譜檢測條件。本方法簡便、快速、靈敏度高、重復性好、實用性強,可實現不同蔬菜基質中丁硫克百威母體的準確定性定量分析。