魔芋多聚糖對改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝異常的機制研究

阮 凌

(西安石油大學 體育系，陜西 西安 710065)

目前，2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)已成為一個人們生活中重要的健康問題，由于生活方式的改變，使其發病率在全球迅速上升，并呈現出逐年增加的趨勢[1]。有研究表明，不良的生活方式將會誘發T2DM，占T2DM發病率的90%[2-3]。T2DM治療的核心目標是通過降低血糖，從而改善胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)。一般來說，可溶性膳食纖維對血糖和血清胰島素有改善的效果[4-6]。因此，通過改變飲食習慣，如攝入更多的高膳食纖維來改善T2DM具有良好的效果。

流行病學的研究證實，攝入高纖維飲食可以起到降低體重和血脂水平的作用。有研究表明，高膳食纖維可以抑制食欲，減少能量攝入，從而起到降低體重的作用。魔芋是一種亞熱帶植物，它是一種可食用的球莖，被稱為天然纖維，長期以來作為亞洲地區的傳統食品。魔芋多聚糖(Konjac Glucomannan,KMG)是一種從魔芋粉中提取的天然多糖類物質。KGM對人體健康有益，是一種高質量的可溶性膳食纖維。國內學者研究認為，KMG是一種有益的營養素，有預防和改善2型糖尿病的效果，KMG顯著降低了血糖和血清胰島素水平，改善了脂質代謝。而KGM調節脂質代謝的機制，促進腸道黏液的生長，改善排便[7]。

本研究旨在通過魔芋多聚糖改善T2MD大鼠血糖，胰島素抵抗，脂代謝指標，炎癥因子和相關蛋白質的表達，試圖發現其潛在的分子機制。

1 研究方法

1.1 材料與方法

FBG、FIN、TC、TG、LDL-C和HDL-C的測定試劑盒(南京建成生物技術有限公司)。TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒進行測試(武漢BOSTE生物技術有限公司)。采用免疫印跡法測試GLUT-4、IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731(武漢BOSTER生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物模型與設計

雄性SD大鼠(180～220 g，7～8周)從西安交通大學實驗動物中心購買。大鼠在動物實驗中心(23±1 ℃，濕度60%～70%，12 h光/12 h暗周期)環境中飼養。所有大鼠進行1周的適應性喂養。SD大鼠(n=40)被隨機分成2個實驗組，喂食標準嚙齒動物飲食的正常對照組(NC;n=10)和高脂飲食組(HFD;n=30)。高脂飼料含40%脂肪、18%蛋白質、42%碳水化合物。喂養2周后，高脂飲食組在禁食12 h后，注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。在STZ注射72 h后尾靜脈取血，測試血糖值，將血糖維持在16.7 mmol/L以上的大鼠確定為2型糖尿病大鼠[8]。

2型糖尿病大鼠模型建立后，將所有大鼠分為3組，正常對照組(NC，n=10)，喂養普通飼料；2型糖尿病模型大鼠隨機分為2組，2型糖尿病組(DM，n=10)；喂養普通飼料8周；2型糖尿病魔芋多聚糖組(DK，n=10)，以含有KMG的飲食喂養持續8周[9]。

1.3 魔芋多聚糖飼料配方

采用10%的魔芋多聚糖混合基礎飼料(面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮25%、豆料20%、魚粉2%、骨粉3%；其中，脂肪提供能量占18%、蛋白質占32%，碳水化合物占50%)添加成分和水按一定比例混合成團，將混勻的飼料團塊填充到實驗大鼠特配飼料自制裝置中，壓實，然后用注射器活塞將飼料推出，魔芋多糖特配飼料采用高溫烘干。

1.4 血清指標測定

8周后實驗結束時，所有大鼠禁食12 h，取血液和腓腸肌樣本。從腹主動脈采集血液樣本，用離心機在3000 r/min下離心15 min，然后取血清。使用全自動分析儀測試TG(mmol/L)、TC(mmol/L)、LDL-c和HDL-c水平(mmol/L)。采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6的含量。

1.5 口服葡萄糖耐受性試驗(OGTT)實驗

在實驗結束時進行口服葡萄糖耐受試驗(OGTT)實驗。SD大鼠分別在對照組和2型糖尿病模型組隨機選取。禁食12 h后,使用尾靜脈的血液樣本測試FBG和FIN。然后,大鼠接受OGTT測試(2克/千克體重)[8]。胃內注射后，在0、30、60和120 min尾靜脈測量血糖和血胰島素水平[10-11]。

1.6 免疫印跡法測試

骨骼肌稱重后用冷鹽水清洗，IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731的腓腸肌蛋白表達的用免疫印跡法測定。SDS-PAGE電泳后，將蛋白質轉移到PVDF膜，室溫下用TBS/T封閉液體(TBS含有0.1%～20.5%脫脂奶粉)PVDF膜孵育2 h，TBS/T緩沖液沖洗3次,每次5 min。用抗稀釋劑稀釋(TBS/T含有5%BSA)稀釋一個抗體(抗體為1∶1000制備)，并在4 ℃的TBS/T緩沖液沖洗，孵育PVDF膜，3次/5 min，然后膜和兩個電阻(1∶5000)，封閉稀釋液體在室溫孵育1 h，TBS/T緩沖液沖洗。將化學發光試劑A液體與B液體混合，孵育PVDF膜1 min，并在凝膠成像器中成像。

1.7 統計分析

各組數據應用SPSS 16.0統計軟件和Excel 2007加載軟件包進行分析。實驗數據采用平均數±標準差(Mean±SD)表示，所有數據比較在確定方差齊性后(P>0.05)進行組間比較；各組間采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異，具有統計學意義，P<0.01為具有非常顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 每組大鼠OGTT后葡萄糖和胰島素的變化

采用OGTT測試，與NC組相比，DM組從30～120 min(P<0.01)血糖和胰島素含量明顯升高(圖1A)。與DM組相比，DK組血糖(P<0.05，圖1A)和胰島素水平顯著性降低(P<0.05，圖1B)。

2.2 各組大鼠血清指標的變化

由表1可知，各組大鼠血糖、血清胰島素和HOMA-IR的變化。與NC組相比，DM組中FBG和FIN升高(P<0.05)。經過8周的KMG補充，與DM組相比，DK組血糖、血清胰島素和HOMA-IR(P<0.05)明顯減少。

表1 各組大鼠血清指標的變化

DM組中的TG和TC水平明顯高于NC組(P<0.05)。此外，與DM組相比，DK組的TG和TC水平顯著下降(P<0.05)。然而，每組HDL-c和LDL-c沒有顯著變化(P<0.05)。

2.3 各組大鼠炎癥細胞因子的變化

由去2可知，各組大鼠IL-6和TNF-α的變化，與NC組相比，DM組中的IL-6和TNF-α顯著增加(P<0.05)，與DM組相比，DK組中TNF-α顯著減少(P<0.05)。

*P<0.05，與NC組相比；#P<0.05,與DM組相比。圖2 不同處理組大鼠炎癥細胞因子的變化

2.4 各組大鼠GLUT-4的蛋白質表達

由圖3可知，與NC組相比，DM組GLUT-4蛋白水平明顯下降(P<0.01)。8周的魔芋多聚糖干預，DK組的GLUT-4蛋白表達高于DM組(P<0.01，圖3)。

*P<0.05，與NC組相比。圖3 不同處理組大鼠GLUT-4的蛋白質表達

2.5 各組大鼠IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731蛋白在腓腸肌中的表達

由圖4可知，與NC組相比，DM組和DK組中的pIRS1Ser730顯著降低(P<0.05)，與DM組相比，pIRS1Ser730在DK組顯著增加(P<0.05)。DM組和DK組中，IRS2明顯高于NC組，而DM組和DK組中pIRS2Ser731明顯低于NC組。然而，IRS1的表達在各組之間沒有顯著的差異(P>0.05)。

*P<0.05，與NC組相比；#P<0.05,與DM組相比。圖4 不同處理組大鼠IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731蛋白在腓腸肌中的表達

3 討論

在本研究中，筆者采用高脂飲食誘導和STZ注射的方式，建立了2型糖尿病模型大鼠。與前人的研究一致，使用HFD和STZ可以建立了T2MD大鼠模型[12]，高脂飲食會導致高血糖，高胰島素血癥和胰島素抵抗[13-15]。使用HFD和STZ誘導這種2型糖尿病大鼠模型與人類T2MD的發生相同[16]。本研究發現KMG對T2DM大鼠的血糖、血脂、炎癥因子和胰島素信號通路蛋白的表達，有改善的作用。

本研究結果表明，2型糖尿病組葡萄糖耐受性和胰島素抵抗能力受損，因此，血糖和血清胰島素水平明顯高于正常對照組。同時，高血糖還可激活各種信號通路，導致ROS大量增加并誘導胰島素抵抗[17]。胰島素抵抗的特征是T2DM發病機制的中心環節，導致T2DM大鼠糖代謝紊亂，同時，由于胰島素抵抗和胰島素缺乏，血清TG、TC和LDL-c的含量升高，成為T2DM的常見特征。有研究表明，2型糖尿病的脂質增加造成機體脂代謝異常，過量的脂質是導致胰島素抵抗的重要原因之一[18-19]。

KMG的補充顯著地改善了血糖水平和胰島素抵抗。每天攝入KGM對改善血糖有益。本研究結果表明：KMG補充8周后，對2型糖尿病大鼠的血糖和胰島素抵抗得到改善。此外，攝入KGM對HOMA-IR也有改善作用。最新研究表明，KMG在降低血脂和改善IR方面均有效。魔芋多聚糖可以降低血糖和血脂，同時促進腸道蠕動。本研究與前人的研究結果一致，2型糖尿病組大鼠的TG和TC水平明顯較高，但補充KGM后TG和TC水平下降[20]。其機制可能是KMG吸收水分后膨脹，可以填充胃腸道，減少食物攝入量，增加飽腹感。然而，HDL-c和LDL-c在各組之間沒有顯著差異。

2型糖尿病除高血糖、高脂血癥和胰島素抵抗外，還被作為一種炎性疾病。炎癥細胞因子，如TNF-α和IL-6可降低機體胰島素敏感性，同時，TNF-α和IL-6升高也損害胰島素的信號通路。最新研究發現，TNF-α造成胰島素抵抗表現為高脂血癥，即外周胰島素抵抗和胰島素信號通路的抑制。結果表明，2型糖尿病大鼠，炎癥細胞因子TNF-α和IL-6水平升高，然而，補充KMG飲食可以降低TNF-α水平。Kang等證明，KMG可明顯改善機體炎癥反應。另有研究表明，TNF-α水平升高與胰島素抵抗有關。Alipourfard等[2]研究發現通過改善胰島素敏感性，機體的TNF-α表達也減少。本研究也印證了KMG也可以通過降低TNF-α的表達，從而達到改善胰島素的敏感性的作用。

本研究試圖通過IRS的信號通路蛋白表達，來說明魔芋多聚糖改善2型糖尿病大鼠的作用。胰島素受體(IRS)在胰島素信號通路中起到非常重要的作用，IRS是胰島素受體后信號細胞內傳導的重要組成部分，在胰島素抵抗中起到重要作用。IRS-1和IRS-2的主要作用已經得到了證實，它們作為細胞表面受體和細胞內信號級聯之間的紐帶。IRS-1是胰島素信號通路的上游通路蛋白，是胰島素抵抗的負調節器，其磷酸化的增加會導致IRS-1酪氨酸磷酸化，并調節細胞對胰島素的反應，從而起到調節糖代謝。同時，IRS-2在胰島素信號介導系統中也起著重要的作用，它具有調節胰島素和細胞因子分泌作用。此外，GLUT-4是胰島素信號轉導通路蛋白的關鍵因素，它將葡萄糖從血液轉移到組織中。本研究發現，2型糖尿病大鼠的GLUT-4蛋白水平顯著降低，而IRS-1的表達沒有顯著變化。因此，8周KMG補充對周圍胰島素抵抗有明顯的改善作用，這可能與骨骼肌胰島素信號通路障礙的改善有關。前人研究表明，HFD/STZ誘導大鼠出現胰島素抵抗，炎癥因子表達的增加，胰島素信號通路上的蛋白質水平也發生變化。本研究中pIRS1Ser730在KMG補充組中比在T2MD組顯著增加。此外，Ser307的IRS1磷酸化及其降解是由慢性胰島素抵抗引起的。然而，沒有觀察到各組之間IRS1在腓腸肌中的表達有顯著性差異。同時，KMG補劑可調節GLUT-4蛋白水平、IRS-2和IRS-2Ser731蛋白的表達，降低血糖，提高胰島素的敏感性。

4 小結

本研究發現KMG對HFD和STZ誘導T2DM大鼠，有降低血糖、血脂，改善胰島素抵抗，同時有抗炎的效果，但關于IRS信號通路的可能機制仍需進一步研究。