洋蔥AcSVP基因的克隆及其表達分析

陳 微,惠林沖,李威亞,楊海峰,郇國磊,何林玉,繆美華,陳振泰,潘美紅*

(1.江蘇省連云港市農業科學院,江蘇 連云港 222000;2.江蘇省云臺農場有限公司,江蘇 連云港 222000)

洋蔥是百合科二年生草本植物,是我國主要的出口蔬菜品種之一,也是推進農業供給側結構性改革的優質品種。洋蔥含有豐富的營養成分,但其先期抽薹會影響產量和品質,使商品性變差,因此,深入了解洋蔥的抽薹開花的調控機理,分離鑒定洋蔥抽薹開花的關鍵基因,解析洋蔥抽薹開花的機制,可為耐抽薹洋蔥種質資源創新和遺傳育種提供理論依據。

抽薹開花標志著植物從營養生長到生殖生長的轉變,是植物重要的發育特征之一。植物的抽薹開花涉及一個復雜的基因調控網絡。對擬南芥的研究發現有5條主要控制開花的遺傳途徑,包括:光周期途徑、赤霉素途徑、自主途徑、春化途徑和年齡途徑。在正常條件下,環境或外部條件如光照(光照強度和光照時間)和低溫是決定植物開花的關鍵因素。植物年齡、碳水化合物同化物(主要是蔗糖)和激素(主要是赤霉酸)等內源因素與外部因素的共同作用確定開花時間。

植物中的MADS-box基因家族是被研究最多的轉錄因子之一,其特征在于N-末端區域的MADS-box保守結構域,參與DNA結合和二聚化[1-2]。MADS-box在植物的花器官形成以及開花時間的調控等方面起到關鍵作用[3-4]。SVP作為MADS-box家族基因的開花抑制因子,能夠抑制FT的表達[5-6]。SVP突變體導致早花,而擬南芥中SVP的過表達能延遲開花并影響花的發育[7-8]。相關研究表明,SVP蛋白通過與FLC蛋白相互作用形成二聚體來調控下游開花整合子基因；另外SVP可能是開花調控網絡的另一個中心調節因子,因為該基因受溫度、自主和赤霉素途徑的控制,并直接抑制莖尖和葉片中SOC1的轉錄[9]。

目前已從擬南芥[7]、葡萄[10]、獼猴桃[11]、大白菜[5]、小麥[12]、水稻[13]、水仙[14]等多種植物中克隆到SVP的同源基因。在獼猴桃中,已經鑒定出4種SVP的同源基因,并在擬南芥中進行了功能鑒定；SVP基因在冬季芽中的表達增加,但在花分化前下調表達,表明這些基因可能對芽休眠和開花具有重要作用[11]。

鑒于SVP基因在植物花發育過程中的重要作用,本研究利用轉錄組測序結果,克隆了洋蔥的SVP基因的同源序列,并對其后續的生物學信息進行了分析,以期為進一步研究該基因在洋蔥花芽分化中的作用提供依據,為闡明洋蔥成花調控的分子機理提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試洋蔥材料“70-1”采自連云港市農業科學院試驗基地。其在自然條件下生長，采用小株留種的方法,于2018年9月播種,11月定植,4月下旬抽薹開花。于洋蔥的營養生長期S1采集葉片,于抽臺前期S2(有花薹在洋蔥內部但未抽出)采集葉片、臺和花蕾(未開放),于抽薹后期S3(外部可見花薹)取葉片、臺和花蕾(未開放),于開花期S4取開放的花朵,用液氮處理后,儲存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2 總RNA的合成和cDNA的合成

采用Trizol試劑盒(生工,中國上海)提取洋蔥的RNA；以提取的植株總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA,所用的反轉錄試劑是vazyme Hiscript?II Q RT Super Mix for qPCR (+gDNA Wiper) (Vazyme,中國南京)。操作參照試劑盒說明書進行。

1.3 基因的克隆和生物信息學分析

以營養生長期的洋蔥葉片總RNA反轉錄所得的cDNA為模板,以AcSVP-F1和AcSVP-R1為引物(表1)，克隆AcSVP基因的全長。反應體系包括：2× Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP (10 mmol/L) 1 μL、引物(10 μmol/L)各2 μL、Phanta Max Sμper-Fidelity DNA Polymerase (1 μmol/L) 1 μL、模板cDNA 2 μL,用水補足至50 μL。反應條件為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30 個循環;72 ℃ 5 min。

表1 實驗所用的引物

對目標條帶進行回收、T-A克隆、測序。利用ExPASy數據庫中的ProtParam工具對洋蔥的SVP基因的氨基酸序列的理化性質進行分析;利用在線SOPMA程序對蛋白質的二級結構進行預測;利用Blastn檢索和DNAMAN 軟件對序列的同源性進行分析；利用MEGA生物學軟件進行氨基酸多重序列比對及系統發育樹構建;利用STRING網站,預測SVP蛋白的共表達網絡。

1.4 洋蔥AcSVP基因的熒光定量分析

設計特異引物進行表達分析,以Actin-F和Actin-R作為內參,用熒光染料法進行qRT-PCR 表達分析,所用的熒光試劑是AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix (Vazyme，中國南京)。反應體系為10 μL。每個植株樣品3個機械重復。擴增的反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,共40個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s;40 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 洋蔥AcSVP基因的克隆與序列分析

用特異性AcSVPF/R為引物,以洋蔥營養生長期葉片的cDNA為模板,擴增得到1個CDS序列,命名為AcSVP；該基因具有1個完整的開放閱讀框,其CDS區全長為741 bp,編碼246個氨基酸,預測蛋白質的相對分子質量為27798.10,理論等電點(pI)為8.77(圖1)。利用NCBI網站中的BLASTp對AcSVP的氨基酸序列進行分析,發現其包含1個MADS-box結構域及1個K-box結構域,屬于MIKC型MADS-box基因(圖2)。

圖2 AcSVP基因的CDS序列和推測的氨基酸序列

圖1 洋蔥SVP基因擴增的PCR產物

利用ExPASy程序分析發現,該蛋白的氨基酸序列含有帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)37個、帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)34個；其不穩定系數為60.59,屬于不穩定蛋白。應用SOPMA對該蛋白質的二級結構進行預測分析,結果顯示,SVP含有54.47%的α-螺旋、2.85%的β-轉角、11.38%的延伸鏈和31.3%的無規則卷曲。

利用STRING網站,預測與SVP蛋白相互作用的其他蛋白,結果發現,SVP與多個開花蛋白相互作用，共同調控植物的成花過程(圖3)。

圖3 AcSVP蛋白的共表達網絡

2.2 洋蔥AcSVP氨基酸序列的同源性分析

利用DNAMAN軟件,將洋蔥AcSVP基因所編碼的氨基酸序列與其他植物中SVP基因進行同源性比對,結果(圖4)發現：洋蔥AcSVP的氨基酸序列與水仙的相似性較高，為60.57%；與小蘭嶼蝴蝶蘭的氨基酸序列的同源性為54.09%；與油棕的同源性為57.59%；與龍眼的同源性為55.69%；與葡萄的同源性為55.47%。

2.3 洋蔥AcSVP的系統進化樹分析

為了進一步研究洋蔥AcSVP與其他植物SVP同源基因的系統進化關系,選取了一些植物的SVP蛋白,利用MEGA 6.0軟件構建了系統進化樹(圖5),其中算法選擇N-J算法,重復抽樣次數為1000次。結果顯示,洋蔥與水仙、小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛、菠蘿、油棕、馬來西亞野生蕉的親緣關系較近,與葡萄、擬南芥、赤豆、芝麻等的親緣關系較遠。

圖5 一些植物SVP基因的系統進化分析結果

2.4AcSVP基因表達的定量分析

為了確定AcSVP基因在洋蔥生長過程中的表達情況,將不同發育時期的各個器官進行實時熒光定量PCR, qPCR反應的熔解峰單一,無雜峰,特異性良好。定量結果(圖6)顯示：AcSVP基因在洋蔥葉、花蕾等器官中均有表達,但在不同器官中的表達量存在明顯差異；AcSVP基因在花蕾中具有最高的表達量,在葉中的表達量較高,在花和臺中的表達量低。

圖6 洋蔥AcSVP基因的時空表達特性

AcSVP:洋蔥; DlSVP1:龍眼; EgSVP:油棕; NSVP2:水仙; PeAGL22:小蘭嶼蝴蝶蘭; VvSVP:葡萄。圖4 洋蔥與其他物種SVP氨基酸序列的比對結果

3 討論

SVP是植物調控開花的重要轉錄因子,屬于MADS-box基因家族,受溫敏途徑、自主途徑與赤霉素途徑的調控,在調控植物的成花時間、花發育以及休眠等方面發揮重要的作用[15-17]。目前在許多植物中都發現了SVP同源物,包括一年生和多年生物種。研究顯示, SVP家族的1 個關鍵基因MdMADS50在控制蘋果芽休眠及萌發中起重要作用[18],并介導赤霉素信號參與蘋果花芽孕育的調控[17]。桃中2個SVP同源基因在芽的休眠和花芽分化過程中起到一定的作用[19]。本研究利用轉錄組的數據,克隆得到了SVP的全長序列；序列分析發現,AcSVP具有MIKC型MADS-box基因的典型特點,包括1個MADS-box結構域和1個K-box結構域；系統進化分析進一步表明,AcSVP基因與水仙、小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛等物種的SVP基因遺傳距離較近。

另有研究發現，SVP蛋白通過與FLC蛋白相互作用形成復合體來抑制FT和SOC1基因的表達，從而延遲開花[20]。組織特異性分析表明,SVP基因在擬南芥的花原基中表達,在花中不表達[7]。梅(Prunusmume)中的PmSVP1基因一般在營養組織中表達,在花芽分化發育期間的表達量降低[21]。在桉樹中發現SVP主要在芽、葉和根以及未開放的花蕾中表達[22]。本研究發現,SVP基因在洋蔥葉和未開放的花蕾中的表達量較高,在開放的花中表達量低,這與前人的研究結果相似,推測洋蔥中的SVP基因作為開花的抑制因子在植物成花轉變中發揮作用。但是,洋蔥AcSVP與其他MADS-box開花相關基因、蛋白的作用關系還需進一步探討研究。

4 結論

本研究克隆得到了1個SVP同源基因,命名為AcSVP。AcSVP包含1個741 bp的開放閱讀框,編碼246個氨基酸。該基因具有MIKC型基因的保守結構域。AcSVP與水仙的親緣關系較近。AcSVP在洋蔥未開放的花蕾中表達量最高,在花薹抽出前的葉中次之,在花中的表達量最低。