CD147和EGFR及HIF-1α在透明細胞腎細胞癌中的表達及意義

黃凇崧，何常，嚴瑞

(1.貴州醫科大學附屬醫院 病理科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 臨床醫學院 病理學教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 臨床醫學院，腎內科教研室，貴州 貴陽 550004)

腎細胞癌是泌尿系統中常見的惡性腫瘤，占成人腫瘤的3%[1-2]。腎細胞癌源于腎小管上皮細胞，分為4個亞型，其中最常見的病理類型是透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，占腎癌總數的75%[3]。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellar matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN；cluster of differentiation 147，CD147)，其作用是介導細胞間及細胞間質間的粘附作用，通過多種途徑刺激腫瘤細胞及周圍間質成纖維細胞合成并釋放基質金屬蛋白酶，降解細胞外基質，促進腫瘤的轉移和浸潤[4]；表皮生長因子受體(epidermal growth factor recepter，EGFR)是ErbB受體家族的一員，廣泛表達于細胞膜表面，與配體EGF結合后促進腫瘤細胞的增殖和生長[5]；缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被認為是腫瘤組織缺氧的內在標志，同時也是腫瘤細胞缺氧的調節因素[6]。以往的研究對CD147、EGFR及HIF-1α單一檢測較多，對3者聯合檢測和相關關系探討較少[4-6]。因此，本研究通過分析CD147、EGFR及HIF-1α在不同臨床分期和病理分級的ccRCC標本和腎盂腎炎標本中的表達差異，探討CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中的表達及其與臨床病理特征的關系，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源、主要試劑與儀器

1.1.1標本來源 收集2011年1月—2016年12月存檔的診斷為ccRCC的手術切除腎臟標本為ccRCC組，同期慢性腎盂腎炎病理標本作為對照組，要求所有病例均經病理診斷證實，臨床病理資料完整且術前均未行放、化療及免疫治療。最終納入ccRCC組標本40例，年齡24～80歲、平均(56±18)歲，男24例、女16例，根據2002年美國癌癥聯合委員會腎癌分期標準Ⅰ～Ⅳ期分別有16例、21例、2例及1例，按Fuhrman病理分級標準Ⅰ～Ⅳ級分別有14例、24例、1例及1例；對照組標本20例，年齡38～72歲、平均(52±12)歲，男13例、女7例，包括腎及輸尿管結石所致慢性腎盂腎炎16例，原發性慢性腎盂腎炎4例。

1.1.2主要試劑與儀器 鼠單抗CD147、鼠單抗EGFR、兔單抗HIF-1a及SP-9000二抗試劑盒(北京中杉金橋)，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB，DAKO公司)，0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、4%中性甲醛、二甲苯、0.5%鹽酸酒精、1%碳酸鋰及蘇木素(德國merck)，石蠟切片(德國Leica公司)，BX517-32ETO型OLYMPUS正置顯微鏡及圖像采集系統(日本OLYMPUS)。

1.2方法

1.2.1腎組織中CD147、EGFR及HIF-1α蛋白的表達 應用免疫組織化學鏈霉素抗生素蛋白-過氧化苯酶(streptavidin-perosidase，SP)法檢測腎組織中CD147、EGFR及HIF-1α的蛋白表達，提取細胞或者組織中的特定化學物質，作為抗原或半抗原免疫兔子等實驗動物，制備特異性抗體(一抗)，再用一抗作為抗原去免疫動物制備二抗，并用生物素或辣根過氧化物酶處理后與前述抗原成分相結合，將抗原放大，DAB顯色，陽性部位顯示棕黃色顆粒。CD147、EGFR及HIF-1α一抗濃度分別為1 ∶100、1 ∶100及1 ∶200，陰性對照片用PBS代替一抗，用已知為陽性的腎細胞癌為陽性對照。

1.2.2判讀標準 所有切片采用雙盲法，由2個病理醫師分別閱片評分。CD147以細胞膜著色為陽性，EGFR以細胞漿著色為陽性，HIF-1α以細胞漿(核)著色為陽性。每張切片計數10個高倍視野所有細胞及陽性著色細胞數，計算陽性百分率。按陽性細胞百分率無、<30%、30%～70%及>70%分別計0、1、2及3分，再根據染色強度為無、淺黃色、黃色及棕黃色分別計0、1、2及3分；將以上2項得分相加作為最后判斷結果，規定0分為“-”，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～6分為“+++”，最終將“-”和“+”計為陰性，“++”和“+++”計為陽性[7]。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，定量數據以均數±標準差表示；定性數據以頻數、率或比(%)表示，組間差異采用χ2檢驗，表達強度與淋巴結轉移、遠處臟器轉移和腫瘤分期之間的關系分析采用Kruskai-WallisH檢驗；P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CD147、EGFR及HIF-1α表達

結果顯示，CD147以細胞膜著色為陽性，EGFR以細胞漿著色為陽性，HIF-1α以細胞漿(核)著色為陽性(圖1)；ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達率均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 ccRCC組和對照組CD147、EGFR及HIF-1α 的表達(SP)

表1 ccRCC組和對照組CD147、EGFR及HIF-1α 的表達[n(%)]

2.2ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與病理分級的關系

結果顯示，隨著病理分級加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表達增強，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與臨床分期的關系

結果顯示，隨著臨床分期加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表達增強，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

2.4ccRCC組CD147、EGFR和HIF-1α表達的相關分析

ccRCC組CD147與EGFR的表達呈正相關(r=0.990，P=0.010)，CD147和HIF-1α 亦呈正相關(r=0.963，P=0.037), EGFR與HIF-1α呈正相關(r=0.987，P=0.013)。

表2 ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與病理分級的關系[n(%)]

表3 ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與臨床分期的關系[n(%)]

3 討論

ccRCC多位于腎臟皮質，實性多見，腫瘤與周圍腎組織分界較清楚，可形成推壓式邊界和假包膜[8]。腫瘤呈金黃色或多彩狀，含有脂質，部分可見囊腔、壞死、出血和鈣化[9]。腫瘤細胞的轉移和浸潤是一個多步驟及多階段的復雜過程，而在腫瘤細胞向鄰近組織浸潤和轉移過程中基底膜細胞基質的降解是其中的必要階段，腫瘤細胞的浸潤和轉移受腫瘤微環境各種因素的影響[10]。ccRCC病變形成過程中涉及癌基因和抑癌基因的表達失調[11-12]。

CD147是由269 個氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白，相對分子量為45～55 kD，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin super family，IgSF)的成員之一[13]，分子的N端呈高度糖基化[14]。本次研究結果表明CD147的表達與腫瘤的病理分級相關，呈正相關關系，腫瘤細胞的分化程度越低，腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達強度就越強，提示腫瘤的分化一定程度上受CD147的影響[15-16]。本研究結果亦顯示CD147的表達強度與臨床分期呈正相關，表明CD147可以提示ccRCC的不良預后；對照組CD147的陽性表達率低于ccRCC組，差異有統計學意義(P<0.05)，并且組織分化程度越低，CD1147表達越強，這似乎提示CD147可能參與ccRCC的發生發展過程，可影響腫瘤的惡性程度及演進。

EGFR是一種受體酪氨酸激酶，具有酪氨酸激酶活性，屬于ErbB 受體家族的成員，是細胞膜表面的糖蛋白受體，其相對分子量約為170 kD[14]。當EGFR與配體-EGF相結合，在EGFR酪氨酸激酶活性的作用下使酪氨酸殘基磷酸化激活EGFR，從而促進腫瘤細胞的增殖和生長[14]。腫瘤中EGFR通過調節與腫瘤細胞生長和增殖相關的信號通路，促進腫瘤的發生、轉移和侵襲，使腫瘤細胞表現出無限生長及增殖的特點[14]。本研究發現，在ccRCC中EGFR蛋白表達的陽性率為75%，EGFR在細胞膜或者胞漿混合表達結果沒有臨床病理意義，僅胞漿表達結果與腫瘤分級呈正相關關系。有學者發現，卵巢癌血清EGFR的過高表達預示著腫瘤患者治療的預后不良[17]；有研究也表明EGFR在轉移性非小細胞肺癌的突變率顯著高于早期非小細胞肺癌，提示EGFR基因的突變影響著腫瘤的發生和發展，可通過預測 EGFR的突變率預估腫瘤的發展程度[18]；EGFR可以促進腫瘤血管的生成，從而增強腫瘤細胞的增殖能力，目前已經成為了腫瘤治療的新靶點[17]。本研究結果亦顯示，EGFR陽性表達于胞漿，在ccRCC中呈高表達，表達量與ccRCC臨床分期呈正相關關系，表明EGFR可能參與ccRCC的發生與進展。

在常氧時，HIF-α的半衰期非常短，是因為脯氨酸羥化酶(pro1yl hydroxylase，PHD)能夠識別其氧依賴降解區中兩個特殊的脯氨酸殘基并將其羥基化[19]。羥基化的HIF-α與腫瘤抑制蛋白(von Hippe1-Lindauprotein，pVHL)相結合，pVHL復合體通過聚集E3泛素連接酶，從而介導26S蛋白酶體對HIF-α的降解作用[20]；缺氧時，氧依賴降解區的PHD活性受到抑制，穩定的HIF-β亞基和HIF-α亞基形成二聚體，從細胞質穿到細胞核，最終連接到缺氧反應元件(hypoxia responsive，HRE)上啟動靶基因轉錄[19-20]。腫瘤細胞在缺氧的微環境中能被誘導產生HIF-1α，反之，HIF-1α的陽性區能提示腫瘤組織存在缺氧部位[21]。腫瘤細胞對適應缺氧環境的辦法之一就是提高糖酵解效率，另一個重要的辦法就是形成多血管體系，使HIF-1α能夠加強其下游靶基因，從而通過調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成影響腫瘤微血管的密度，促進腫瘤的生長及轉移[21]。腫瘤細胞中低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)的活化還可以通過調節缺氧相關基因，如VEGF、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及趨化因子受體4(chemokine receptor4，CXCR4)等的表達，促進腫瘤間質上皮轉化、腫瘤細胞增殖，從而維持腫瘤細胞的生存，是腫瘤發生發展的重要因素[22-24]。腎細胞癌為富含血管的實體腫瘤，實體腫瘤的生長、浸潤和轉移依賴于腫瘤新生血管的形成，而新生血管的形成又依賴于腫瘤血管生長因子[25]。本實驗結果顯示，HIF-1α在ccRCC組織高表達與病理分級和臨床分期呈正相關關系。研究結果提示腫瘤的快速生長可導致腫瘤微環境呈缺氧狀態，使HIF-1α表達增多且明顯活化，幫助腫瘤細胞加快適應缺氧微環境，從而加速了腫瘤細胞的異質性和腫瘤血管生成，進而導致腫瘤侵襲力增強，患者預后差。

綜上所述，CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中高表達，且與腫瘤分期正相關，提示腫瘤血管生成增多可能是CD147、EGFR及HIF-1α共同作用的結果。