川參通注射液中總酚酸、總黃酮及單糖大類成分的含量測定*

何峰，余明麗，姚光哲，張昀**

(1.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州瑞和制藥有限公司，貴州 貴陽 550002)

川參通注射液由丹參、當歸、麥冬及川芎提取精制而成，臨床上用于良性前列腺增生癥所致的小便不暢、排尿費力及淋漓不盡等癥[1-2]。通過文獻調研及前期試驗發現，川參通處方中主要含有酚酸、黃酮、萜烯及糖類等成分[3]，其中酚酸是一類含有酚環的有機酸，包括單羥基苯甲酸和雙羥基苯甲酸等[4-5]；黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結構的活性化合物[6-8]；單糖是不能再水解的糖類，是構成各種多糖的基本單位[9-11]。由于川參通注射液所含化學成分十分復雜，僅通過測定某個或某幾個化學成分的含量已無法滿足中藥注射劑的質量控制要求，因此為盡可能地明確所含大類成分的種類及含量，本研究采用紫外分光光度法對川參通注射液中總酚酸、總黃酮和單糖大類成分進行分析和含量測定，確定大類成分在固形物中的比例，為川參通注射液質量控制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 川參通注射液成品(批號170909～171015)，4 mL/支，購自貴州瑞和制藥有限公司；D-無水葡萄糖對照品(批號110833-201205)、原兒茶醛對照品(批號110810-201007)及蘆丁對照品(批號100080-201408)購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要儀器與試劑 TU-1810紫外分光光度計(北京普析)，GR-202電子天平(日本AND公司)，MS105分析天平(梅特勒公司)；鹽酸、硫酸及無水乙醇(成都科龍)，亞硝酸鈉(重慶江川)，硝酸鋁(汕頭西隴)，蒽酮(廣東光華)，實驗用水為純化水。

1.2方法

1.2.1總酚酸的含量測定 (1)溶液的制備：取原兒茶醛對照品適量，加1 mol/L鹽酸制成0.10 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置50 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸至刻度，取上述溶液1.0 mL置10 mL量瓶中用1 mol/L鹽酸至刻度，即得供試液。(2)線性關系：取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸至刻度，1 mol/L鹽酸作空白；于紫外分光光度計281 nm處測定吸光度，以標樣濃度(mg/L)對吸收度(A)進行線性回歸[12]。(3)精密度和穩定性：取對照品溶液0.7 mL，按照“(2)”項下重復測定5次，以峰面積計算精密度；取“(1)”項下稀釋溶液1 mL，測定不同時間的吸光度[13]。(4)重現性試驗：取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取注射液(總酚酸為2.053 g/L)0.5 mL，置50 mL量瓶中，加入1 mol/L的鹽酸至刻度得樣品稀釋液；平行6次量取該稀釋液1 mL，置10 mL量瓶中，加入0.10 g/L的對照品溶液0.2 mL，加入1 mol/L的鹽酸至刻度作為供試品溶液，測定吸光度[14-15]。

1.2.2總黃酮的含量測定 (1)溶液的制備：取蘆丁對照品適量，加60%乙醇制成0.207 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，量取上述溶液1.0 mL至25.0 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min。加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min；加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，作為供試品溶液[16]。(2)線性關系：取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0及6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，按照“(1)”項下方法制備，用水6 mL同法做空白；于紫外分光光度計500 nm處測定吸收度，以標樣濃度(g/L)對吸收度(A)進行線性回歸。(3)精密度和穩定性：取對照品溶液4.0 mL，按照“(2)”項下重復測定5次，以峰面積計算精密度；取“(1)”項下稀釋溶液1 mL，測定不同時間的吸光度[17]。(4)重現性試驗：取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取川參通注射液(總黃酮為18.3 g/L)0.5 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得樣品稀釋液；平行6次量取1 mL上述液至25 mL量瓶中，加入0.207 g/L的對照品溶液2 mL，按照“(1)”項下方法制備，作為供試品溶液，測定吸光度[18]。

1.2.3單糖的含量測定 (1)溶液的制備：取無水葡萄糖對照品適量，加水制成0.305 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得樣品稀釋液。再量取上述液0.5 mL至10 mL試管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作為供試品溶液[19]。(2)線性關系：取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4及0.5 mL，分別置于10 mL試管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，于紫外分光光度計625 nm處測定吸收度，以標樣濃度(mg/L)對吸收度(A)進行線性回歸。(3)精密度和穩定性：取對照品溶液0.3 mL，按照“(2)”項下重復測定5次，以峰面積計算精密度。取“(1)”項下稀釋溶液0.5 mL，測定不同時間的吸光度。(4)重現性：量取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取川參通注射液0.5 mL(單糖為53.1 g/L)，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度。平行6次量取上述液0.5 mL至10 mL試管中，分別加入0.030 5 g/L的對照品溶液1 mL，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作為供試品溶液，測定吸光度[20]。

1.3統計學分析

使用Excel 2007版軟件進行數據統計分析，計算精密度、穩定性、重現性、回收率的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，線性分析采用最小二乘法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1方法學考察

2.2含量測定

10批川參通注射液的總酚酸平均含量為2.05 g/L，其中最低含量為2.04 g/L，最高含量為2.06 g/L，各批次產品質量相對較為均一，總酚酸平均含量占川參通注射液固含物的2.53%，占比較低；10批川參通注射液的總黃酮平均含量為18.21 g/L，其中最低含量為17.92 g/L，最高含量為18.52 g/L，各批次產品質量相對較為均一，總黃酮平均含量占川參通注射液固含物的22.43%；10批川參通注射液的單糖平均含量為53.58 g/L，其中最低含量為52.91 g/L，最高含量為54.28 g/L，各批次產品質量相對較為均一，單糖平均含量占川參通注射液固含物的66.01%，占比最高。

表1 不同批號川參通注射液中總酚酸、總黃酮及單糖的測定結果

3 討論

從10批川參通注射液的總酚酸、總黃酮和單糖的測定結果可以看出，廠家生產的成品批間均一性較好，不同批次間的差異性較小。3個大類成分中單糖含量最高，單糖測定中供試品的水解反應至關重要，通過比較最終選擇蒽酮硫酸溶液作為反應試劑，結果穩定可靠，重現性好[22]。同時有報道硝酸鋁與總酚酸所形成的絡合物，其穩定性較差，通過比較不適合應用于川參通注射液中丹參總酚酸的測定，因此本實驗選擇鹽酸法進行總酚酸的測定[23]。本實驗運用紫外分光光度法對川參通注射液的總酚酸、總黃酮及單糖含量進行了測定，并對方法的精密度、穩定性、重現性以及加樣回收率進行了考察，結果表明所建立的分析方法精密度、穩定性高，重現性、加樣回收率好，符合定量分析要求。

測定波長的選擇依據的是每個化學成分都在對應的波長下有特定的吸收，因此，選擇測定波長時，應在一定的波長范圍內掃描，選擇有最大吸收峰的波長作為測定波長[24]。例如在黃酮類化合物的紫外吸收帶中，不同的黃酮在統一吸收帶中的吸收強度各不相同，異黃酮在黃芪總黃酮中所占的比例較大，通過大量的實踐證實：使用紫外分光光度法測定特定波長下黃芪總黃酮的含量，不僅具備操作簡便的特點，而且具備良好的重現性[25]。最終通過實驗確定選擇通過測定500 nm吸收值測定總黃酮的含量，通過測定281 nm吸收值測定總酚酸的含量，通過測定625 nm吸收值測定單糖的含量。

川參通注射液為國家二類新藥，是目前臨床上唯一用于良性前列腺增生癥的純中藥注射劑，其局部靶向性的注射方式為產品療效提供確切保障，近年來為本省經濟發展做出了較大貢獻。中藥具有多成分、多靶點的治療特點，單一的化學成分的含量已無法滿足其質量控制要求[26]，因此大類成分的分析作為中藥發揮藥效的物質基礎研究不可或缺。根據《中藥注射劑安全性再評價質量控制要點》等文件中關于中藥注射劑質量控制要點的規定，多成分制成的注射劑所測各類成分之和應大于總固體的80%[26]，本文在對川參通注射液大類成分研究時參考各藥味化學成分及提取精制工藝，選取總酚酸、總黃酮及單糖為檢測對象，涵蓋了該品種所具有的大類物質基礎，同時分別選取品種中所含的原兒茶醛、蘆丁和D-無水葡萄糖為對照，大大增加了檢測結果的可靠性，本文研究有利于川參通注射液的深入研究，為該品種的安全性再評價工作提供了有力的實驗支撐。