BRCA2蛋白表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系*

孫紫君，楊宇石，黃瑾瑾，冉立，毛大華，鐘愉，徐澍*

(貴州醫科大學附屬醫院 病理科，貴州 貴陽 550004)

乳腺癌是全球范圍內發病率第一位的女性惡性腫瘤[1]。研究表明，乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepblilty gene 2，BRCA2)與乳腺癌發生發展及其家族遺傳性密切相關。BRCA2基因本質上是一種抑癌基因，通過參與同源重組介導的DNA修復達到抑制腫瘤發生發展的作用。因此，BRCA2基因突變的女性患乳腺癌的風險大大增加，并且其基因突變與乳腺癌的早期發病密切相關[2]。BRCA2基因突變往往是可遺傳的，而遺傳的BRCA2突變使攜帶者疾患早期發病的乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥的風險大大增加[3-4]。在BRCA2突變細胞中，DNA損傷修復反應被抑制，易導致出錯的DNA修復增加，最終引起基因組穩定性降低[5]。BRCA2基因檢測的相關研究已經成為乳腺癌及卵巢癌患者分子檢測的重要組成部分和研究內容，研究發現的BRCA2的有意義突變仍然占少數，某些BRCA2突變并不影響蛋白表達及增加患者疾患乳腺癌的概率，對乳腺癌診療意義不大，而且成本較高[6]。本研究采用臨床病理常用的免疫組化方法檢測乳腺實體腫瘤中BRCA2蛋白的表達，分析其與患者臨床病理特征的關系，探究BRCA2蛋白在乳腺實體腫瘤中的表達狀況改變及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料

1.1.1對象 選取2008—2010年病理科97例乳腺浸潤性導管癌患者蠟塊組織為研究對象，選擇同期30例癌旁正常乳腺組織作為對照；收集存檔切片，由2位乳腺病理專業的主任醫師雙盲法根據《WHO(2012版)乳腺病理學和遺傳學分冊》診斷標準重新判讀并分級[7]。乳腺癌分子分型依據最新標準：Luminal A(ER/PR陽性且PR>20%、HER-2陰性、Ki67<20%)，Luminal B樣HER2陰性(ER/PR陽性、HER-2陰性且PR<20%、Ki67>20%)，Luminal B樣HER2陽性型(ER/PR陽性、HER-2陽性)，HER2陽性型(ER和PR均陰性、HER-2陽性)，三陰性型(ER和PR均陰性、HER-2陰性)，所有HER-2陽性患者均行赫賽汀治療。

1.1.2主要試劑 兔抗人單克隆抗體BRCA2一抗(博士德)，檢測滴度為1 ∶50，一抗稀釋液(碧云天)，二抗稀釋液(碧云天)，二甲苯，無水乙醇，Mayer蘇木素染液(索萊寶)，公司山羊血清，檸檬酸鹽(均購于貴州永博鑫公司)，PBS粉劑(博士德公司)。

1.2方法 采用免疫組織化學方法檢測BRCA2蛋白，BRCA2蛋白表達定位于細胞核，免疫組化結果由2位主任病理醫師雙盲法按照以下標準評分：高倍鏡隨機選取10個視野，計數1 000個乳腺癌細胞或正常乳腺腺上皮細胞，以陽性細胞數/1 000為陽性百分率，陽性百分率評分標準定為1分(1%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)。免疫組化結果評分(IRS)為強度和百分比的乘積，根據IRS評分將BRCA2染色分為陰性(IRS 0)、弱(IRS 1～4)、中度(IRS 6～8)和強(IRS 9～12)，將免疫組化≤8分判讀為低水平表達組、≥9分者為高水平表達組[8]。

1.3統計學方法

收集97例乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征(年齡、腫瘤大小、分子分型、月經情況、病理分級、淋巴結轉移及TNM分期)，使用χ2檢驗方法分析癌組織中BRCA2蛋白表達與臨床病理特征的關系，P<0.05表示差異有統計學意義。使用Kaplan-Meier-Meier和Longranktest統計學方法，分析不同水平的BRCA2表達與患者無進展生存時間(PFS)和總體生存時間(OS)的對比。

2 結果

2.1BRCA2蛋白在乳腺組織及乳腺癌中的表達

正常乳腺組織中BRCA2高水平表達率為90%，乳腺浸潤性導管癌中高水平表達率為69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺組織中高水平表達高于乳腺浸潤性導管癌，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2BRCA2表達與臨床病理學特征的關系

結果顯示，癌組織中BRCA2蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、分子分型、月經情況、病理分級、淋巴結轉移及TNM分期無關，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

正常乳腺組織 浸潤性導管癌

表1 乳腺癌組織中BRCA2表達與患者臨床病理特征的關系

2.3BRCA2表達與復發轉移之間的關系

BRCA2表達與復發轉移差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4BRCA2表達與乳腺癌預后的關系

結果顯示，癌組織中BRCA2蛋白表達與患者PFS及OS有關(P=0.049、0.036)。見圖2。

圖2 BRCA2表達與患者PFS及OS的關系

3 討論

腫瘤的發生是一個多步驟的過程，引發腫瘤的往往是調節基因組完整性、細胞分裂和死亡基因的多種突變。細胞基因組的完整性受DNA損傷信號和DNA修復機制的密切調控。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2與乳腺癌和卵巢癌發展的關系在20多年前就已經得到證實[9]。BRCA基因突變就與基因組不穩定和許多惡性腫瘤發病率增加有關[10-11]。基因組不穩定性是正常細胞向腫瘤細胞轉化和腫瘤進一步惡化的動力。BRCA基因屬于毛細血管擴張性共濟失調突變(ataxia-telangiectasia mutated ATM)介導的DNA DSBs修復信號通路家族，在維護基因組完整性方面發揮重要作用[12-13]。其中，BRCA2基因的有害突變可能導致DNA損傷的積累，使女性攜帶者更易患乳腺癌和卵巢惡性腫瘤，通常在絕經前發生[14]。BRCA2突變對乳腺癌的組織學病理狀態、分期和分級，淋巴結轉移均有影響，是決定乳腺癌預后和生存率的因素[15]。總的來說，與其他基因突變攜帶者相比，BRCA2的攜帶者表現出更高的腫瘤分期、分級和ER表達陰性，并表現出更多的血管侵犯[16]。在一項針對日本乳腺原位癌患者的基因研究中發現，BRCA2基因突變引發的腫瘤是常是中或低分化的。BRCA2基因突變攜帶者和非攜帶者之間的組織學等級沒有顯著差異。但是與非攜帶者相比，BRCA2基因突變的患者常表現為2級或3級。BRCA2突變對于乳腺癌的患病率本身沒有顯著影響，但是BRCA2基因突變的患者發病年齡顯著提前[17]。

BRCA2(13q12.3，染色體13:堿基對32、315、479～32、399、671)是一種大的3 418個氨基酸蛋白。它包含27個外顯子，覆蓋了大約84.2 kb的基因組DNA[18]。在n端BRCA2包含一個轉錄激活域(TAD)。中間部分由外顯子11編碼，包含8個與RAD5126結合的被稱為BRC重復序列的保守基序。一個DNA結合域位于BRCA2蛋白的羧基端，由保守的螺旋結構域、3個寡核苷酸結合折疊(OB)和一個(T)結構域組裝而成，有利于BRCA2結合雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈DNA(ssDNA)。BRCA2的C端包含兩個NLS和一個TR2結構域。時至今日，已經在BRCA2中發現了1 800多個突變。這些突變主要包括移碼插入、缺失和無義突變，導致早期截斷或非功能蛋白產生。BRCA2基因突變不僅容易導致乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌，還與惡性皮膚和眼部黑色素瘤、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌和胃癌有關[19-22]。

BRCA2蛋白通過同源重組完成精確的DNA損傷后修復過程，在維持基因組完整性方面發揮著至關重要的作用。BRCA2蛋白功能的喪失可導致基因組不穩定，使得DNA損傷在細胞中不斷堆積，最終導致非致瘤細胞轉化為腫瘤啟動細胞或腫瘤干細胞(CSCs)并且向進一步的腫瘤進化。研究表明，即使是同一腫瘤內的癌細胞，其引發腫瘤的能力，在程度上有很大的不同。CSCs群體具有長期的自我更新能力，并具有分化為其他腫瘤細胞類型和啟動腫瘤生長的潛力[23]。鑒于CSCs具有廣泛的自我更新和克隆潛能，再加上腫瘤細胞具有高度的基因組不穩定性，CSCs可能作為癌癥進化的引擎發揮作用。因此，腫瘤內異質性依賴于CSCs的進化，這反映在新出現腫瘤克隆的數量上[24]。

本研究發現，正常乳腺組織中BRCA2高水平表達率為90%，乳腺浸潤性導管癌中高水平表達率為69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺組織中高水平表達顯著高于乳腺浸潤性導管癌(P<0.05)。說明BRCA2蛋白可能通過促進DNA損傷修復對乳腺組織起保護作用,BRCA2蛋白的表達缺失可能導致乳腺癌.BRCA2蛋白與乳腺癌預后情況存在顯著相關性，低水平表達時腫瘤預后較差(P<0.05)。綜合本組實驗結果及過往研究，BRCA2低水平表達與乳腺癌惡性生物學行為密切相關，其作用機制可能與BRCA2蛋白維持基因組完整性有關，當BRCA2蛋白低水平表達時，其促進DNA損傷修復的功能降低，基因組的穩定性和完整性遭到破壞，可能導致腫瘤的發生發展和腫瘤干細胞的形成。最終導致較差的預后。而BRCA2表達與年齡、腫瘤大小、分子分型、月經情況、病理分級、淋巴結轉移、TNM分期及復發轉移差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與本研究的病例有限有關。總而言之，BRCA2蛋白表達對乳腺浸潤性導管癌預后的具有預測價值。