吉法酯保護干眼癥大鼠的機制研究*

糜玲，周波，李永1,，彭金剛1,，湯磊，黃家宇*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

干眼癥是眼科常見疾病，由多種因素誘發(fā)，癥狀因人而異，常見癥狀有異物感、干澀感、眼癢、分泌物黏稠、畏光以及視力波動等[1]。近年來，隨著對干眼癥的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的干眼癥病理機制都有炎癥因子的參與[2-3]，同時細胞凋亡也起著關(guān)鍵性的作用[4-8]。淚腺細胞凋亡的增加可以減少淚液的分泌，同時引起眼部相關(guān)組織的損傷[9]；淚腺細胞長期的凋亡和損傷會造成眼部相關(guān)組織炎癥保持持續(xù)的激活狀態(tài)，炎癥和凋亡相互影響，從而使干眼癥患者更容易產(chǎn)生眼干、眼澀等不適癥狀[10]。吉法酯(Gefarnate)是一種促黏蛋白分泌劑，不但做為胃黏膜保護劑在臨床上得到廣泛使用[11]，而且對干眼癥也有一定的保護作用，Dota等[12]研究發(fā)現(xiàn)吉法酯可以增加結(jié)膜杯狀細胞的數(shù)量及促進黏蛋白5AC(mucoprotein-5AC, MUC5AC)等黏蛋白分泌，恢復(fù)并保護淚膜的完整性，改善角膜表皮的損傷，當劑量高于0.3%時效果顯著且未觀察到明顯副作用；Toshida等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)吉法酯在兔結(jié)膜堿灼燒模型中也獲得同樣結(jié)果，但具體的保護機制尚不明確。吉法酯存在2種構(gòu)型，即4Z構(gòu)型和4E構(gòu)型，市售吉法酯是這兩種異構(gòu)體的混合物，且4Z ∶4E≈30 ∶70[15]。本課題組前期建立了單一構(gòu)型吉法酯的合成路線，并分別合成了兩種單一構(gòu)型吉法酯(純度>98%)供本次研究使用[16-17]。因此，本研究通過使用蛋白印記分析法(Western blot)檢測大鼠淚腺中活化的半胱氨酸蛋白3(Cleaved-Caspase 3)、B淋巴細胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、Bcl2關(guān)聯(lián)的X蛋白(Bcl2-Associated X, Bax)、Bcl2相關(guān)的死亡促進蛋白(Bcl2-Associated death promoter, Bad)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metallo Protein-9, MMP 9)的表達，采用免疫組織化學(xué)染色觀察眼表MUC5AC及MMP-9的表達來探討不同構(gòu)型吉法酯對干眼癥大鼠的保護機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只雌性Wistar大鼠，6周齡，體質(zhì)量160～180 g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。在各12 h明暗周期、濕度40%～50%的22 ℃飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2主要藥物和試劑 4Z構(gòu)型和4E構(gòu)型吉法酯由貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點實驗室湯磊教授課題組制備，純度大于98%；RIPA裂解液和彩虹廣譜蛋白marker(北京索萊寶)，鼠單克隆抗體Bax、Bad及Bcl2(美國Santa)，兔單克隆抗體Cleaved-Caspase 3(美國CST)，熒光二抗兔抗和鼠抗(英國Abcam)，β-Actin、GAPDH、MMP9、MUC5AC抗體及SA1022免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德)，脫脂奶粉(北京博奧拓達)，SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及PMSF(上海碧云天)，ZLI-9018DAB顯示試劑盒(北京中杉金橋)。

1.1.3主要儀器 Odyssey CLx近紅外熒光成像儀(美國Gene)，SDS-PAGE電泳儀(德國BioRaid)，NIKON TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon)，P70D20N1P-G5微波爐(廣東格萊士)，手持勻漿機(北京天根生化科技)。

1.2方法

1.2.1干眼癥動物模型的建立及分組 40只大鼠隨機分為正常組、生理鹽水組、4Z吉法酯治療組(4Z組)、4E吉法酯治療組(4E組)和混合吉法酯治療組(4Z ∶4E=30 ∶70，混合組)，每組8只。除正常組外，其余組大鼠建立干眼癥模型，即皮下注射6 g/L東莨菪堿氫溴酸鹽，4次/d，0.5 mL/次，持續(xù)28 d，同時采用風(fēng)扇聯(lián)合除濕機模擬高流通性、低濕度(相對濕度為30%～40%)的環(huán)境，其中4Z組、4E組及混合組分別使用10 g/L的各構(gòu)型吉法酯滴眼液治療，生理鹽水組用同體積的生理鹽水滴眼，5次/d(9、11、13、15及17點)，每只眼睛20 μL/次，連續(xù)治療2周。正常組大鼠置于正常環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2取材 治療14 d后冰上斷頸處死大鼠，迅速取出淚腺和眼球。眼球固定于Bouin氏固定液保存于4 ℃，淚腺保存于-80 ℃。固定72 h后眼球進行常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋處理，平行于眼軸作6 μm連續(xù)切片；-80 ℃冰箱取出淚腺組織，加入400 μL RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)后剪碎組織，在冰上使用手持勻漿機研磨成漿后冰上靜置1 h，3 340 r/min，4 ℃離心30 min，吸取上清液保存于-80 ℃?zhèn)溆谩５鞍锥亢蠹尤氲鞍咨蠘泳彌_液，95 ℃水浴5 min后蛋白保存于-20 ℃。

1.2.3免疫組織化學(xué) 組織切片常規(guī)梯度乙醇脫蠟至水后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書步驟進行抗原修復(fù)，封閉后甩干不洗，加入相應(yīng)一抗與組織切片4 ℃孵育過夜，第2天PBS清洗后與親和素標記山羊抗兔IgG和HRP-標記山羊抗兔IgG孵育，顯微鏡下DAB顯色，當組織呈現(xiàn)棕色即陽性顯色反應(yīng)時洗去DAB，蘇木素復(fù)染后脫水封片，200倍顯微鏡下觀察MMP9和MUC5AC的表達。

1.2.4Western blot 按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書制備相應(yīng)濃度分離膠和上層膠，各組蛋白按60 μg上樣(Cleaved-Caspase 3上樣量為120 μg)。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃與相應(yīng)一抗孵育過夜，第2天孵育二抗后使用Odyssey CLx近紅外熒光成像儀進行曝光，拍攝β-Actin、GAPDH、Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、MMP9及Bcl2蛋白的表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

蛋白質(zhì)的灰度值、免疫組織化學(xué)陽性面積統(tǒng)計均使用Image J V1.8.0軟件，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1眼表黏蛋白表達

與生理鹽水組相比，4Z、4E和混合組大鼠眼表上皮細胞的MUC5AC表達均增加(P<0.05或P<0.01)，且4E組和混合組分別高于4Z組(P<0.05)。見圖1。

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與4Z組比較，P<0.01。

2.2眼表和淚腺炎癥因子MMP-9表達

與生理鹽水組相比，4Z、4E和混合組大鼠眼表和淚腺中MMP-9的表達均降低(P<0.05或P<0.01)，且4E組在眼表和淚腺中均低于4Z組(P<0.05)，但混合組大鼠僅淚腺中MMP-9的表達低于4Z組(P<0.05)。見圖2和圖3。

注：(1)與生理鹽水組比較，P<0.01；(2)與4Z組相比，P<0.05。

注：(1)與生理鹽水組比較，P<0.05；(2)與4Z組相比，P<0.05。

2.3淚腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表達

4Z、4E和混合組大鼠淚腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表達較生理鹽水組減少，Bcl-2蛋白表達增加(P<0.05或P<0.01)；與4Z組相比，4E組大鼠淚腺中Bcl-2的表達增加，Cleaved-Caspase3、Bax及Bad表達減少，而混合組僅Bcl2表達增加和Cleaved-Caspase3表達減少(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

3 討論

在干眼癥的發(fā)病機制中，細胞凋亡起著重要的作用，已有研究顯示干眼癥患者結(jié)膜組織上皮細胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達增高，導(dǎo)致細胞凋亡指數(shù)上升，促凋亡因子與致炎因子表達的增加激活凋亡通路[18]；狗干眼模型中發(fā)現(xiàn)凋亡標志物p53的存在，同時在淚腺中發(fā)現(xiàn)Bcl2蛋白和凋亡誘導(dǎo)因子Bax的失衡能導(dǎo)致凋亡率上升[19]。在凋亡過程中，Caspase家族起著重要的作用，已在多個干眼癥模型中發(fā)現(xiàn)Caspase家族的身影[20]。本研究利用蛋白免疫印跡法對淚腺中與凋亡相關(guān)的蛋白Caspase 3、Bax、Bad及Bcl2進行檢測，結(jié)果表明經(jīng)過各種構(gòu)型吉法酯的治療后，與生理鹽水組相比，Bax、Bad及Caspase 3在淚腺中的表達量明顯下調(diào)(P<0.05)，Bcl 2表達量明顯上調(diào)(P<0.05)，且4E組對這些蛋白的調(diào)控作用明顯優(yōu)于4Z構(gòu)型，而混合組僅Bcl2表達增加和Cleaved-Caspase3表達減少。這指示在對干眼癥大鼠的保護作用中，抑制淚腺細胞凋亡方面，吉法酯通過抑制淚腺細胞的凋亡保護干眼癥大鼠，且4E構(gòu)型的保護作用優(yōu)于4Z構(gòu)型。

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與4Z組相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01。

炎癥在近年干眼癥的研究中已被多次證明，在干眼患者的眼表、淚腺和連接神經(jīng)的整合系統(tǒng)出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤，炎性介質(zhì)和炎性細胞因子的顯著增多，同時發(fā)揮抗炎作用的乳鐵蛋白分泌顯著減少[4-5]。炎癥既是改變干眼病理的誘因，同時也是病變進一步發(fā)展的結(jié)果[21]。本次實驗通過Western blot檢測淚腺中MMP9的表達，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，經(jīng)吉法酯治療后，4Z、4E和混合組淚腺和眼表中發(fā)現(xiàn)少MMP9表達(P<0.05)，且4E組及混合組MMP9在眼表和淚腺中的表達水平明顯低于4Z組。這提示吉法酯能通過抑制干眼癥大鼠的淚腺及眼表的炎癥保護干眼癥大鼠，且4E吉法酯的保護作用優(yōu)于4Z吉法酯。

近年來，結(jié)膜杯狀細胞的缺失導(dǎo)致黏蛋白分泌減少，進而引起淚膜不穩(wěn)定已引發(fā)學(xué)者們的關(guān)注[21]。眼表上皮細胞分泌產(chǎn)生膜結(jié)合型黏蛋白，與分泌性黏蛋白形成保護、潤滑眼表的親水性屏障，分泌性黏蛋白包括可溶性與形成凝膠的MUC5AC，有助于淚液的穩(wěn)定性以及保持淚膜的親水性[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)干眼癥大鼠的眼表MUC5AC表達明顯下降，各構(gòu)型吉法酯能明顯增加眼表MUC5AC的表達量，且4E組多于4Z組(P<0.05)。

綜上所述，本次研究結(jié)果表明各構(gòu)型吉法酯可以增加干眼癥大鼠眼表MUC5AC的表達，減少淚腺中Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、Bcl及MMP-9的表達，且4E構(gòu)型吉法酯和混合式吉法酯優(yōu)于4Z構(gòu)型吉法酯。