沉默Linc00152對胰腺癌細胞MIA PaCa-2侵襲及遷移的影響*

何美玲，楊喆，戴研平，雷珊，高曉勤

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550004；2.遵義醫藥高等專科學校，貴州 遵義 563006)

胰腺癌作為消化系統的惡性腫瘤，是發達國家癌癥相關死亡的第四大病因，患者的總體5年生存率約為8%[1]。由于胰腺癌起病隱匿，早期不易被診斷，許多患者確診時癌細胞已經發生了轉移[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，存在于細胞核或細胞質內，不能編碼蛋白質，在各種腫瘤中異常表達[3]。研究表明，lncRNA Linc00152在乳腺癌組織和細胞中均高表達，下調Linc00152可顯著抑制腫瘤的增殖和轉移[4]；Linc00152在膠質母細胞瘤中通過miR/AKT2/NF-κB在體內體外發揮致癌作用[5]；Linc00152可直接與miR-193a/b-3p結合調節CCND1的表達，從而影響肝細胞癌的進展[6]。然而，有關Linc00152在胰腺癌中的生物學功能和潛在機制卻鮮有報道。本研究通過敲低胰腺癌細胞株MIA PaCa-2中Linc00152表達，探討Linc00152對胰腺癌細胞侵襲及遷移的影響，為治療胰腺癌建立潛在的治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料和試劑

20例配對的人胰腺癌組織及相對應癌旁組織收集于華中科技大學附屬同濟醫院膽胰科。胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、BxPC-3、Capan2及人胰腺正常細胞HPDE均購于美國ATCC細胞庫，高糖DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、轉染用OPTI-MEM培養基購自美國Gibco公司，Matrigel 基質膠購自美國BD公司，RT試劑盒、PCR相關SYBRP及逆轉錄試劑盒購自鼎國生物有限公司，兔抗人單克隆抗體vimentin和N-cadherin及鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自武漢賽威爾生物技術有限公司，LipofectamineTM2000和相關轉染試劑盒購自Invitrogen公司。Linc00152的沉默RNA(siRNA)、陰性對照序列(NC)、Linc00152及GAPDH上下游引物均由上海生工生物技術有限公司設計合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將MIA PaCa-2細胞和HPDE培養于高糖DMEM培養基，BxPC-3細胞和Capan2細胞培養于RPMI-1640培養基，細胞均在10% 胎牛血清、5% CO2、37 ℃的條件下培養，每2 d更換1次新鮮培養基，細胞融合度達85%左右進行傳代培養。

1.2.2Linc00152的相對表達量檢測 采用逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測，Trizol法提取人胰腺癌組織、癌旁組織或各細胞株中的總RNA，按試劑盒說明書操作。經70%乙醇洗滌后的RNA加無RNA酶雙蒸水水稀釋，測定RNA濃度及純度。取總RNA 1 μg，根據Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，采用RT-q PCR法測定Linc00152的表達水平。本研究以GAPDH為內參照，Linc00152上游引物序列為5′-AAAATCACGACTCAGCCCCC-3′、下游引物序列為5′-AATGGGAAACCGACCAGACC-3′，GAPDH上游引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，以2-ΔΔCt計算分析結果。選擇Linc00152的相對表達水平最高的胰腺癌細胞株進進行下一步的研究。

1.2.3細胞轉染及干擾效率檢測 取對數生長期MIA PaCa-2細胞(Linc00152的相對表達水平最高)胰酶消化后重懸，調整密度接種于6孔板，待細胞融合65%左右時換液。將MIA PaCa-2細胞分為Linc00152沉默組和NC組，按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行轉染，Linc00152沉默組轉染si-RNA抑制序列沉默Linc00152的表達，NC組轉染陰性對照序列(si-NC)作為對照(NC組)。si-RNA序列為TAGGCGATACGATGCTTTA-3′，si-NC序列為TAATCGCTACGATGCACTA-3′。轉染6 h后換液，繼續培養42 h后，步驟同1.2.2。

1.2.4沉默Linc00152后MIA PaCa-2侵襲與遷移的細胞數 采用Transwell實驗檢測，侵襲實驗：取已經稀釋過的magtrigel基質膠50 μL加入transwell小室，置于37 ℃培養箱30 min。調整2組轉染后的細胞株MIA PaCa-2密度為2×107/L，取細胞懸液200 μL接種于鋪有magtrigel的上室中。上室為無血清培養基，下室為20%胎牛血清完全培養基600 μL。培養箱中繼續孵育24 h后，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，PBS 洗凈后于100倍顯微鏡下拍照并記數。遷移實驗步驟同侵襲實驗但不加magtrigel。

1.2.5沉默Linc00152后MIA PaCa-2細胞的相對劃痕愈合率 采用劃痕實驗檢測，分別將2組轉染后的細胞株MIA PaCa-2細胞鋪板，36 h后200 μL槍頭進行劃痕(槍頭經高壓滅菌)，PBS洗凈3次，換無血清培養基后100倍顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照，37 ℃、5%CO2的培養箱繼續培養48 h后再次拍照，測量圖片中劃痕寬度，計算相對劃痕愈合率。相對劃痕愈合率=(平均初始劃痕寬度-平均終末劃痕寬度)/平均初始劃痕寬度×100%。

1.2.6沉默Linc00152后MIA PaCa-2細胞vimentin和N-cadherin蛋白表達 采用Western blot法檢測，蛋白裂解液分別處理2組轉染后的細胞株MIA PaCa-2后提取總蛋白，BAC法測定蛋白濃度，依次制膠、上樣、電泳、PVDF轉膜、洗轉印膜后，5%的脫脂奶粉搖床上室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜。TBST洗滌3次，將PVDF膜放入二抗中室溫孵育2 h，加ECL化學發光液處理，曝光后進行圖像處理和灰度分析。研究設GAPDH作為內參照。

1.3統計學處理

2 結果

2.1胰腺癌組織及胰腺癌細胞中Linc00152的表達水平

如圖1所示，Linc00152在胰腺癌組織中表達顯著高于相應的癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)；Linc00152在胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、Bxpc-3及Capan2中的表達高于人胰腺正常HPDE細胞，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，且在MIA PaCa-2中表達最高。

注：與HPDE比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01；(3)與Normal比較，P<0.001。

2.2轉染si-RNA后MIA PaCa-2轉染效率

沉默組轉染si-RNA抑制序列沉默Linc00152表達MIA PaCa-2 48h后，結果顯示，與NC組比較，Linc00152沉默組細胞中Linc00152表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。表明成功轉染Linc00152抑制序列下調了Linc00152的表達。

注：(1)與NC組比較，P<0.01。

2.3沉默Linc00152后MIA PaCa-2侵襲與遷移的細胞數

如圖3顯示，與NC組比較，沉默組侵襲及遷移的MIA PaCa-2細胞數目均明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。表明沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細胞的侵襲與遷移能力均減弱。

2.4沉默Linc00152后MIA PaCa-2細胞的相對劃痕愈合率

如圖4所示，沉默Linc00152 48h后，細胞的相對劃痕愈合率明顯比si-NC組降低，差異有統計學意義(P<0.01)，表明沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細胞的遷移能力減弱。

2.5沉默Linc00152后MIA PaCa-2細胞vimentin及N-cadherin蛋白表達

Western blot結果顯示，與NC組比較，沉默組MIA PaCa-2細胞vimentin及N-cadherin蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

注：A為侵襲實驗，B為遷移實驗；(1)與NC組比較，P<0.01。

注：A為細胞劃痕實驗，B為相對劃痕愈合率；(1)與NC組比較，P<0.01。

注：A為Western blot電泳結果，B為Western blot結果條形圖；(1)與NC組比較，P<0.01。

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，因其早期發現困難，且當前各種治療效果有限，預后極差。雖然近年來臨床手術及各種綜合治療方法有所改進，但患者5年生存率始終極低，其主要原因之一就是胰腺癌具有高度侵襲轉移的惡性生物學特性，盡早明確胰腺癌侵襲轉移的機制對改善其治療現狀非常必要。

LncRNA越來越受到研究者的廣泛關注，研究表明，lncRNA與腫瘤的發生發展密切相關[7-11]，并從多種途徑上調控基因的表達水平，如轉錄調控、轉錄后調控以及表觀遺傳調控等[12-13]。有研究表明，Linc00152在卵巢癌細胞中下調能抑制卵巢癌細胞的細胞增殖[14]，且Linc00152與多發性骨髓瘤的進展密切相關[15]。盡管Linc00152逐步被證實為多種人類惡性腫瘤形成的重要的基因表達調控器，但是其與胰腺癌侵襲、轉移的關系卻鮮有報道。

本研究通過RT-qPCR法檢測Linc00152在胰腺癌組織及細胞中的表達，結果顯示，與癌旁組織相比，Linc00152在胰腺癌組織中高表達；在幾種胰腺癌細胞系中的表達情況與在胰腺癌組織中的表達情況一致，Linc00152在人正常胰腺細胞HPDE中呈低表達，而在胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、BxPC-3及Capan2中均高表達，提示Linc00152可能參與胰腺癌的發生、發展。為了進一步研究Linc00152與胰腺癌進展的關系，本研究選擇Linc00152相對表達量最高的胰腺癌細胞MIA PaCa-2作為研究細胞，通過在該細胞中沉默Linc00152表達，采用Transwell實驗觀察MIA PaCa-2細胞的侵襲和轉移數目、采用細胞劃痕實驗觀察MIA PaCa-2細胞的相對劃痕愈合率，結果顯示，沉默Linc00152后，MIA PaCa-2細胞侵襲與遷移的細胞數目均明顯減少，提示沉默Linc00152可顯著抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲。上皮間質轉換(EMT)是一種賦予上皮腫瘤細胞間充質特性的過程，包括黏附性降低和運動性增加，是驅動癌癥侵襲轉移的重要過程，已有研究證明EMT參與腫瘤轉移[16-17]。N-cadherin的異常調節與各種腫瘤的轉移密切相關[18-19]，vimentin是一種上皮-間質轉化的中間纖維，研究證明可促進間充質細胞的遷移[20]，這2個間充質標志物的增加在腫瘤轉移和組織分化以及成體組織器官構成具有重要作用。為了深入了解沉默Linc00152對細胞侵襲調節的分子機制，對沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細胞進行了Western blot分析，結果發現沉默Linc00152可顯著下調胰腺癌MIA PaCa-2細胞中vimentin及N-cadherin的表達，提示沉默Linc00152能抑制EMT進程。且同時結合Transwell小室實驗和劃痕實驗結果，提示沉默Linc00152可能是通過下調vimentin、N-cadherin的表達從而抑制EMT進程來抑制胰腺癌的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究通過一系列體外實驗確定了Linc00152對胰腺癌生物學行為的影響，結果發現沉默Linc00152可顯著抑制胰腺癌細胞的體外侵襲和遷移，機制可能與vimentin和N-cadherin的表達下調有關。