MMP28在胰腺癌中的表達和對胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響*

李琳，喻超，潘耀振，陳玲，鄧路，雷林翰，孫誠誼*

(貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州醫科大學 肝膽胰脾重點實驗室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種惡性程度高、早期診斷困難、病情進展快和預后效果差的消化系統惡性腫瘤，胰腺導管腺癌是其最常見的病理類型，約占全部PC的90%以上[1-2]。目前，PC的主要治療方式以手術治療為主，但是大部分PC患者就診時已發生局部轉移，能夠進行手術根除性治療的患者不到20%[3-4]。因此，深入了解PC發生發展的分子生物學基礎，探索PC治療新靶點，有著極為重要的意義[5-7]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一個具有鋅依賴性的內肽酶家族，有20多個不同的基質金屬蛋白酶,可以分為幾類，例如明膠酶、膠原酶、基質溶素及膜型基質金屬蛋白酶[8-9]。MMPs不僅具有降解細胞外基質，也可釋放生物活性片段和生長因子，從而影響生理和病理過程，例如胚胎發育、組織形態、傷口修復、炎癥及癌癥發生發展[10-11]。基質金屬蛋白酶28(matrix metalloproteinase 28，MMP28)是MMPs家族中的一員，MMP28 mRNA在成年人胰腺中高度表達，目前已有研究稱MMP28可以促進肝細胞癌的轉移過程，并和不良預后相關[12-13]，還有評估基質金屬蛋白酶9，MMP28和金屬蛋白酶抑制劑1在大腸癌的診斷和預后中的作用[14]。本研究對MMP28在PC組織與正常胰腺組織的表達進行分析，并通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)檢測MMP28 在PC細胞株PANC-1中的表達，觀察MMP28對PANC-1細胞增殖、遷移與侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株、主要試劑與儀器

實驗所用細胞株為中山大學腫瘤防治中心惠贈，胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)、胰蛋白酶、培養基均購自美國gibco公司，Transwell小室購自美國Corning公司，基質膠購自美國Becton Dickinson 公司，RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，MMP28轉染試劑購自上海吉凱公司，逆轉錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司，MMP28抗體購自美國proteintech公司，CFX96 Bio-Rad熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，ChemiDocTMTouch bio-rad化學發光成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析 通過GEPIA網站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA數據庫中MMP28在PC和對照組織中的表達情況，及MMP28對PC患者無病生存期和總生存期的影響。

1.2.2細胞培養及轉染 人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE和人PC細胞株PANC-1、MIA PaCa-2、Capan-2及BxPC-3分別使用含10%FBS的培養基培養于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養箱中。將PANC-1細胞消化鋪于培養瓶中，105個細胞/瓶，6 h后分別將MMP28對照試劑(negative control，NC)、MMP28下調試劑(Down-MMP28，D-MMP28)及MMP28上調試劑(Up-MMP28，U-MMP28)加入培養瓶中，分別為MMP28對照組(NC組)、MMP28下調組(D-MMP28組)及MMP28上調組(U-MMP28組)。

1.2.3MMP28 mRNA的表達 采用qPCR實驗檢測，選擇處于對數生長期的HPDE、PANC-1、BxPC-3、Capan-2及MIA-Paca2細胞，提取總RNA，選取吸光度值1.8～2.0的樣品進行實驗。依照逆轉錄試劑盒的說明，分別將樣品逆轉錄為cDNA，再選擇GAPDH作為內參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進行qPCR實驗。

1.2.4Western blot檢測MMP28蛋白的表達 選擇3組處于對數生長期的PANC-1細胞，提取其總蛋白，根據蛋白定量結果點樣、電泳、轉膜、封閉、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜及曝光，用Image Lab軟件分析所得條帶的灰度值，檢測MMP28的蛋白表達量。

1.2.5細胞增殖毒性檢測試劑盒(Cell counting kit-8，CCK-8)實驗 取3組處于對數生長期的PANC-1細胞消化并計數，按照3×103個/孔的數量接種于96孔板中，設6、24、48和72 h時間節點，然后在每個對應的時間節點再分別設5個復孔，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于避光條件下置37 ℃恒溫恒濕細胞培養箱孵育2 h后取出，用酶標儀于在450 nm波長處測定吸光度(optical density，OD)。

1.2.6平板克隆實驗 取3組處于對數生長期的PANC-1細胞消化并計數，于6孔板中種植1×103個細胞，置37 ℃恒溫恒濕細胞培養箱中培養14 d后，用4%多聚甲醛固定30 min、0.25%結晶紫染液染色30 min，于流水中沖洗數遍后置烘箱中烘干，拍照記錄。

1.2.7劃痕實驗 取3組處于對數生長期的PANC-1細胞鋪到6孔板中，待孔中細胞長滿后，用200μL的槍頭進行劃痕，然后換無血清培養基進行培養，換液立即拍照，待48 h后再進行拍照。以NC組為對照觀察PANC-1細胞遷移能力。

1.2.8Transwell侵襲及遷移實驗 取3組處于對數生長期的PANC-1細胞，用無血清培養基饑餓處理24 h后消化并計數，種植前上室按基質膠 ∶無血清培養基=1 ∶8的比例鋪上稀釋過的基質膠60 μL(遷移實驗不加基質膠，其余步驟同上)，然后在上室種植含2×104個細胞的無血清培養基細胞重懸液200 μL，下室加入700 μL完全培養基，置37 ℃恒溫恒濕細胞培養箱中培養30 h后取出，用4%多聚甲醛固定30 min、0.25%結晶紫染液染色30 min，用棉簽清洗上室、烘箱烘干，置顯微鏡下拍照記錄。以NC組為對照，觀察不同分組PANC-1細胞的遷移和侵襲能力。

2 結果

2.1MMP28在PC組織和細胞中的表達及其對預后的影響

通過GEPIA網站分析顯示，MMP28在PC組織中的表達高于對照組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)；MMP28對PC預后的影響結果發現，MMP28的表達對PC的無病生存期和總生存期都有影響，差異有統計學意義(P<0.05，圖1B和1C)；qPCR實驗結果顯示，PC細胞系MMP28 mRNA表達高于胰腺導管上皮細胞(HPDE)，差異有統計學意義(P<0.05，圖1D)。

2.2轉染后PANC-1細胞MMP28 mRNA 和蛋白質表達

病毒轉染后的PANC-1細胞通過qPCR和Western blot檢測結果顯示，D-MMP28組MMP28 mRNA和蛋白質表達較NC組下調，U-MMP28組MMP28 mRNA和蛋白質表達較NC組上調，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2.3MMP28對PANC-1細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結果顯示，D-MMP28組與NC組比較，PANC-1細胞OD450下降，而U-MMP28組OD450上升，差異有統計學意義(P<0.05，圖3A)；平板克隆實驗結果顯示，D-MMP28組與NC組比較，PANC-1細胞克隆數量下降，而U-MMP28組克隆數量上升，差異有統計學意義(P<0.05，圖3B和3C)。

2.4MMP28對PANC-1細胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實驗結果表明，D-MMP28組與NC組相比，PANC-1細胞遷移能力下降，而U-MMP28組遷移能力上升，差異有統計學意義(P<0.05，圖4A和4B)；Transwell遷移和侵襲實驗結果表明，D-MMP28組與NC組相比，PANC-1細胞遷移能力和侵襲能力下降，而U-MMP28組遷移能力和侵襲能力上升，差異有統計學意義(P<0.05，圖4C和4D)。

3 討論

PC在早期發生侵襲轉移對治療效果有很大影響，缺乏早期診斷的指標及有效的治療方法是PC死亡率高的主要原因，因此找到有效的檢測指標和治療方法對治療PC至關重要[15-16]。MMP28 在PC中的研究還不清楚。本研究通過對TCGA數據庫進行分析，結果顯示，MMP28在PC組織中的表達與癌旁組織相比升高，并且MMP28的表達對PC的無病生存率和總生存率有影響。進一步通過qPCR實驗探究發現MMP28在人PC細胞中的表達比人正常胰腺導管上皮細胞升高。因此，本研究推測MMP28參與PC的發生發展過程。目前已有研究發現MMP28在癌癥中的作用[17-19]。Zhang等[20]報道MMP28陽性表達與胃部腫瘤直徑，浸潤深度，血管浸潤，淋巴結和遠處轉移以及腫瘤淋巴結轉移階段有關并且可以作為人類胃癌侵襲和轉移的新的獨立預后標志物。Zhou等[21]報道肝細胞癌中MMP28上調通過Notch3信號轉導通路促進轉移，并可預測不良預后。

注：A為MMP28mRNA在組織中的表達，B、C分別為胰腺癌患者無病生存期和總生存期曲線，D為MMP28 mRNA表達量直條圖；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與HPDE比較,P<0.05。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。

為了探究MMP28對PC細胞的影響，本研究分為3組進行實驗，首先進行細胞增殖實驗，實驗結果表明D-MMP28組與NC組相比，PANC-1細胞增殖能力下降，而U-MMP28組增殖能力上升。由此可見MMP28表達增加可促進PANC-1細胞的增殖能力。接下來通過劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測MMP28對PANC-1細胞遷移能力的影響。實驗結果表明D-MMP28組與NC組相比，PANC-1細胞遷移能力下降，而U-MMP28組遷移能力上升。表明MMP28表達增加可促進PANC-1細胞的遷移能力。還通過Transwell侵襲實驗檢測MMP28對PANC-1細胞侵襲能力的影響,結果仍顯示D-MMP28組與NC組相比，PANC-1細胞侵襲能力下降，而U-MMP28組侵襲能力上升。進一步表明MMP28表達增加可促進PANC-1細胞的侵襲能力。通過一系列細胞功能學實驗研究后，結果表明上調MMP28后可以促進PC細胞的增殖，侵襲和遷移。由此初步得出結論，MMP28可能具有調控胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的作用。

注：A為CCK-8實驗結果，B、C分別為細胞平板克隆實驗的形態學和定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05。

注：A、B分別為細胞劃痕實驗的形態學和定量結果，C、D分別為Transwell實驗中細胞遷移能力的形態學和定量結果，E、F分別為Transwell實驗中細胞侵襲能力的形態學和定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05。

綜上所述，MMP28在PC中高表達，并對胰腺癌預后有影響，初步驗證了上調MMP28后可促進PC細胞的增殖、侵襲及遷移能力，但是其具體的作用途徑，臨床數據及分子生物學機制尚未明確，還需要進一步的探索及研究予以闡明。