基于高通量測序分析入境羊毛微生物群落結構特征

韓阿祥，康雨童，豐新倩，謝旦立，關萬春，樓永良

我國是世界上羊毛進口和生產加工大國，每年羊毛進口量不斷增長[1]。進口入境的原羊毛屬于未經加工的產品，其攜帶的病原體具有復雜性及不可預測性等特點[2]，有學者曾在入境羊毛中分離出沙門氏菌[3]、大腸桿菌、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌、化膿棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌等[4]。目前國內關于入境羊毛的檢驗與檢疫方法主要集中在常規的微生物分離培養，但環境中99.8%的微生物不能通過常規的培養方法獲得[5]，因此微生物的常規培養無法全面的反映微生物群落結構的多樣性[6]。隨著高通量測序技術以及生物信息學分析技術的快速發展，使得高通量測序技術在分析微生物的群落結構方面相對于傳統的微生物分離培養具有完整、精確、可信等優勢[7]。近年來16S rRNA擴增子測序廣泛應用于水體[8-9]、土壤[10-11]、食品[12]以及腸道微生態[13-14]的研究。據了解，通過提取羊毛表面微生物的DNA進行高通量測序研究其表面微生物群落結構的方法在國內尚屬首次。常規16S rRNA擴增子測序只能檢測微生物群落的相對豐度，不能得到微生物絕對豐度信息。微生物的相對豐度只表征了一個樣本中微生物類群的相對比例，而近年來，特定環境樣本中某一類群微生物的絕對定量問題受到越來越多研究學者的關注[15]。以往大多數研究往往用相對豐度來進行跨樣本間微生物豐度的比較，當樣本間總微生物絕對含量存在差異時，可能會得出相反的結論[15]。所以，通過微生物16S擴增子絕對定量測序技術獲得微生物絕對豐度信息能為反映微生物群落結構及其動態變化提供更多有價值的參考信息。因此本研究選用微生物16S擴增子絕對定量測序的技術，基于Illumina 2×250 bp的方法獲得5個國家進口的5批次羊毛表面微生物群落結構特征信息，通過后期的分析比對，以期對于海關的進口羊毛風險監測和安全評估提供有效的數據支持。

1 材料與方法

1.1樣本的采集 樣本于2019年4月25日在溫州海關直接獲取，5批羊毛分別來自美國(USA)，阿根廷(ARG)，德國(GER)，比利時(BEL)，法國(FRA)。

1.2微生物的收集處理 使用電子天平(Sartorius, Germany)分別稱取羊毛10 g置于1 L無菌燒杯中，加入600 mL無菌PBS(pH=7.2)浸泡12 h(期間攪拌震蕩以使羊毛表面微生物充分分散于PBS中)，將全部浸泡液用15～20 μm孔徑的定性濾紙(杭州特種紙業有限公司)過濾以去除液體中的大顆粒泥沙等雜質，取其中200 mL濾液以9 000 r/min (Eppendorf 5810R，Germany)離心10 min，將沉淀全部收集到5 mL磁珠管(PowerWater DNA Isolation kit提供)。

1.3DNA的提取 樣品微生物DNA的提取采用PowerWater DNA Isolation kit(Qiagen，Germany)試劑盒完成，具體步驟參照試劑盒說明書。使用DS-11超微量分光光度計(DeNovix，USA)測定所提取DNA的濃度以及純度，符合要求的DNA用于后續測序。

1.4高通量測序 DNA樣品送往上海天昊生物科技有限公司，使用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測基因組DNA完整性，Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)檢測基因組DNA質量，對于合格的樣本檢測區域進行高保真PCR擴增，設置3個重復實驗，同時以標準的細菌/真菌基因組DNA Mix作為陽性對照，DNA的擴增使用的是16S rRNA基因V3-V4區的引物，引物序列(5′-3′)：正向引物Illumina adapter sequence 1+ CCTACGGGNGGCWGCAG，反向引物Illumina adapter sequence 2+ GACTACHVGGGTATCTAATCC。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物是否單一和特異。將同一個樣本的3個平行擴增產物混合，每個樣本加入等體積的AgencourtAMpure XP(Beckman Coulter, USA)核酸純化磁珠對產物進行純化，使用Qubit3.0(Thermo Fisher Scientific, USA)和Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)評估測序文庫質量，最后采用Illumina平臺，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序，后續進行生物信息學分析。

1.5數據分析 為了得到高質量的測序數據，以提高后續生物信息分析準確性，對下機后的原始數據過濾去除低質量的序列；使用FLASH2軟件將雙末端測序得到的成對序列進行拼接，得到merge序列，進一步去除merge后低質量序列；使用Mothur軟件查找并去除序列中的引物；使用Usearch去除總堿基錯誤率大于2的序列以及長度小于100 bp的序列，得到質量和可信度較高的優化序列(Clean reads)，將相似度大于97%的序列聚為同1個OTU[16]，同時使用Denovo模式去除嵌合體序列，最終將產生的OTU代表序列通過與數據庫比對, 進行物種注釋和 OTU 的物種分類。基于Mothur軟件計算α生物多樣性指數：Chao 1[17], ACE, Simpson和Shannon[18]指數。

2 結 果

2.1樣品序列統計和稀釋曲線 對原始下機數據進行質控過濾后，此次采集的5個國家的5批羊毛樣本最終得到1 062 239條序列，平均長度為425.80 bp，共聚類于342條OTU。稀釋性曲線圖中，當曲線隨著抽取序列數的增加而趨于平緩時，說明樣本的測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，樣本稀釋性曲線(圖1)顯示5條曲線在后期階段均已經達到平臺期，測序量的增加不會引起過多OTU數目的增加[19]。

圖1 5批羊毛的樣本稀釋曲線圖Fig.1 Rarefaction curve of five wool samples

表1 5批羊毛樣本的α-多樣性指數Tab.1 α-diversity index of five wool samples

2.2微生物多樣性分析 樣本的Alpha多樣性指數(表1)常常用來反映樣本的物種豐富度以及多樣性，其中Chao1指數和ACE指數是生態學中用來估計物種豐富度的常用指標，指數越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數反映多樣性指標，其值越大說明群落物種的多樣性越高；Simpson指數常用來反映物種的優勢度；5個樣本Chao1指數平均值為220.08，ACE指數平均值為219.78，Shannon指數平均值為2.30，Simpson指數平均值為0.21，其中法國的Shannon指數明顯低于其他4個國家且Simpson指數高于其他4個國家，說明此次研究采集的樣本中法國的樣本群落結構多樣性相對于其他4個國家處于較低的水平。

圖2 基于 OTU 數據的不同樣本微生物群落的主成分分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of all microbial communities based on OTU data

使用主成分分析(PCA)的方法展示本次采集的5個樣本微生物群落結構之間的差異。結果見圖2，由圖可見，除德國和比利時2個國家樣本點距離較近，其余3個樣本距離均相距較遠，說明本次采集樣本中來自不同國家的羊毛表面的微生物組成有差異，其中PC1貢獻度為49.16%，PC2貢獻度為29.34%。

2.3微生物群落結構 通過與數據庫的比對，對OTU進行了注釋。在門水平上(圖3)，本次采集5個樣本共測出的微生物門類按平均豐度大小依次為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、Candidatus_Saccharibacteri、軟壁菌門(Tenericutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)；其中來自阿根廷、德國和比利時的羊毛表面微生物以變形菌門為主，占比超50%，厚壁菌門次之；而美國和法國則與另外3個國家趨勢相反，微生物以厚壁菌門為主，占比超50%，變形菌門次之；在微生物總量絕對豐度層面美國>阿根廷>德國>比利時>法國。屬水平的微生物組成結果如圖4所示，本次采集5個樣本共注釋到122個屬，其中豐度高于1%的有15個屬，阿根廷、德國和比利時3個國家豐度較高的3個菌屬分別是不動桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)；美國豐度前3的菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)；法國豐度前3的菌屬是土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、解鳥氨酸芽孢桿菌屬(Ornithinibacillus)。種水平(圖5)共注釋到了103個種，其中包括一些常見的條件性致病菌：魯氏不動桿菌(Acinetobacter_lwoffii)、黃褐假單胞菌(Pseudomonas_fulva)、腸沙門菌(Salmonella_enterica)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas_maltophilia)。為進一步揭示微生物群落結構在OTU水平的分布特征，基于OTU水平繪制了韋恩圖(圖6)，如圖6所示，本次采集樣本中美國、阿根廷、德國、比利時、法國各個樣本包含的OTU數目分別為194、189、263、149、188個，其中德國的OTU多樣性最高，為263個；比利時的OTU多樣性最低，為149個。5批羊毛所共有的OTU為81個，美國、阿根廷、德國、法國每個國家所獨有的OTU為10、19、47、22個，比利時獨有的OTU為0個。

圖3 樣本在門水平分類等級上的微生物組成Fig.3 Relative abundance and absolute abundance at phylum level

圖4 樣本在屬水平分類等級上的微生物組成Fig.4 Relative abundance and absolute abundance at genus level

圖5 樣本在種水平分類等級上的微生物組成Fig.5 Relative abundance and absolute abundance at species level

圖6 樣本微生物群落OTU水平分布維恩圖Fig.6 Venn diagram based on OTU of microbial community

3 討 論

入境樣本中攜帶的致病菌對于我國的國境衛生以及傳染病預防和控制造成了巨大的挑戰[20]，本研究利用Illumina Miseq測序平臺分析來自美國、阿根廷、德國、比利時、法國5個不同國家的入境羊毛表面微生物群落結構和多樣性的特點和差異。本次研究采集的羊毛樣本的數量以及分布范圍有限，故本次研究的樣本不一定能代表某一國家羊毛中微生物的實際情況，但是利用Illumina Miseq高通量測序技術對于進一步了解我國入境的羊毛樣本的微生物以及病原體提供了1種新的檢驗檢疫技術方法和思路，同時測序還發現了許多未被分類的微生物(Unassigned),驗證了通過高通量測序的方法能夠獲得更加全面的生物學信息，一些未被認識和分類的微生物可以通過測序而體現[21-22]。

本研究中，5個樣本的稀釋曲線(圖1)隨著抽取序列數增加均已達到平臺期，表明測序深度充分，評估OTU的數量接近實際情況。5個批次羊毛樣本微生物群落的α-多樣性如表1，Chao1和ACE的結果表明德國樣本所含OTU數目最高，美國樣本所含的OTU數目僅次于德國，而阿根廷、比利時、法國3個國家各自所含的OTU數目大致相同。Shannon指數和Simpson指數的結果表明德國樣本的微生物群落多樣性最高，法國樣本的微生物群落多樣性遠低于其他4個國家。結合以上4個指數來看，法國的樣本在OTU數目與阿根廷和比利時2個國家相近的情況下，微生物群落多樣性卻遠低于另外兩個國家。

主成分分析(PCA)一般用來反映樣本微生物群落結構的差異，如圖2所示，德國和比利時2個樣本在圖中的距離較近，其他3個國家的樣本則分布的相對較遠，說明德國和比利時2個國家的樣本微生物群落差異較小。有趣的是在德國、法國、比利時3個國家的地理位置、氣候等外界環境因子大體相同的情況下，法國的微生物群落結構卻與德國和比利時有較明顯的差異，根據Brajesh K. Singh的報道[23]，對于牧場的土壤給與不同的處理方法會影響到牧場的微生物群落結構，因此除去地理位置、氣候等環境因子，造成法國樣本微生物群落結構與其他4個國家有較大差異的原因可能跟羊的品種、當地的土壤或者一些人為的操作(比如飼料的差異，抗生素的使用[24])有關。

在微生物群落結構的種屬水平，我們發現了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，這是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性細菌[25],這種菌在生長代謝的過程中形成的蛋白晶體毒素能夠對500多種害蟲具有毒殺作用[26-27]，因此，常被當做生物農藥而廣泛使用，此次檢測結果陽性可能跟當地牧場采取殺蟲措施時選擇的農藥有關；同時我們還檢測到了魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)、腸沙門菌(Salmonellaenterica)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)等臨床上常見的一些條件致病菌，2000年北京市宣武醫院重癥監護病房就曾有過魯氏不動桿菌暴發的相關報道[28]，隨著不動桿菌屬到種鑒定技術的進一步發展，魯氏不動桿菌在臨床上的鑒定以及檢出率也在不斷的攀升[29]，近年來有報道發現魯氏不動桿菌對于光照的抵抗力較30年前明顯增高，其可以出現在光照消毒后的醫療器械表面[30]，因此這種菌更應該引起一線工作人員(海關進出口檢驗檢疫人員、洗毛廠工人和裝卸人員)的重視和防范；嗜麥芽窄食單胞菌以往臨床并不常見，由于近年來一些臨床住院患者使用大量抗生素、免疫抑制劑以及介入性的醫療操作，使得該菌有機會造成感染，其具有先天性以及獲得性的耐藥，因此臨床上處理起來非常困難[31]；檢出的魯氏不動桿菌以及嗜麥芽窄食單胞菌等條件性致病菌一般情況下對于一線工作人員(海關進出口檢驗檢疫人員、洗毛廠工人和裝卸人員)并不會致病，但是當相關的工作人員操作不當、經呼吸道吸入、身體有傷口或者免疫抵抗力下降時，這些條件性致病菌會使人患病對人體造成危害；在中國大陸地區統計的食物中毒病例中，沙門氏菌引起的食物中毒較為常見，引起了全國各地疾控中心以及實驗室的重視[32-34]，有研究人員曾在入境的羊毛樣本中分離出了沙門氏菌[3],這與我們的測序結果相符合，也曾有報道指出兒童沙門氏菌感染的來源更有可能是來自于環境污染而不單單是食物來源[35]，因此這就需要我們對于入境羊毛的風險重新評估，同時加強對于入境羊毛的管控以及消毒處理，防止沙門氏菌對于羊毛相關的從業人員的身體健康和生態環境造成嚴重的危害。

羊毛中病原體含量較多且疫情復雜，依靠常規的培養分離等檢驗檢疫手段，無法對于羊毛的疫情進行全面的掌控。本研究使用的16S rRNA擴增子測序的方法可作為出入境檢驗檢疫機構一個備選的檢驗方法，與常規的檢驗方法相補充，從而獲得更全面入境樣本病原體信息，同時提醒相關機構重視羊毛的熏蒸、消毒等除害化處理，一線從業人員更應該做好自我防護以切斷傳播途徑。這對于我國的國境衛生，相關行業的安全生產以及人民的健康安全都是十分重要的。

利益沖突：無