MLVA分型在布魯氏菌臨床分離株中的應(yīng)用探索

呂燕寧，陳麗娟，李仁清，孫玉蘭，陳艷偉，王全意

北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心科研項目培育專項(No.2015-BJYJ-08)

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌侵入機(jī)體而引起的一種世界范圍流行的人獸共患傳染病。人間布病為我國法定的乙類傳染病[1]。近年來全國布病疫情呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2]，防控形勢十分嚴(yán)峻[3]。對布病病人進(jìn)行正確、合理、及時的治療，同時追溯感染來源并對傳染源進(jìn)行有效控制是布病防控中的重要環(huán)節(jié)。

布病的臨床表現(xiàn)多種多樣，而且許多癥狀沒有特異性，患病早期有發(fā)熱、出汗、渾身疼痛等癥狀，類似普通感冒或流感樣表現(xiàn)[4]。還有一些病人出現(xiàn)肝脾腫大、黃疸等表現(xiàn)，需要與病毒性肝炎相鑒別[5]。由于布魯氏菌致病的特殊免疫病理機(jī)制，布病在臨床上存在復(fù)發(fā)與重復(fù)感染，病人會出現(xiàn)二次或多次發(fā)病的現(xiàn)象。首次患布魯氏菌病后，在傳染源存在的情況下，可以再次或多次患病，除部分為復(fù)發(fā)外，不能排除二次感染發(fā)病[6]。對于二次或多次就診的患者而言，患者主訴多為乏力、出汗、肌肉關(guān)節(jié)疼痛，布病抗體檢測又一直呈陽性，所以臨床醫(yī)生很難分清患者是普通感冒，是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，還是布病復(fù)發(fā)或是重復(fù)感染[7]。急性期布病患者治愈后又重新發(fā)病，是復(fù)發(fā)還是重復(fù)感染而再次生病，這是目前臨床上很難用實驗室手段來區(qū)分的，因為大多數(shù)布病患者血液中的抗體可以持續(xù)多年，且滴度較高。用血清學(xué)檢測難以區(qū)分復(fù)發(fā)或重復(fù)感染[7]。對于布病的復(fù)發(fā)與重復(fù)感染，在患者的臨床處置以及公共衛(wèi)生領(lǐng)域的傳染病疫情處置程序上均有不同，對于布病復(fù)發(fā)患者重在關(guān)注臨床治療，要考慮感染病原是否耐藥，是否需要改變治療方案以及患者對于治療的依從性如何等問題。而對于重復(fù)感染的患者則需考慮是否以及如何再次接觸了傳染源，并應(yīng)及時采取措施控制或消除傳染源，切斷傳播途徑等。因此對這兩種情況的科學(xué)判斷不僅能給與布病患者以明確的診斷，為臨床用藥提供理論依據(jù)，對指導(dǎo)臨床合理用藥，減少過度治療和藥物毒副作用對人體的傷害，降低藥物異常反應(yīng)的發(fā)生率[7]，有著指示性作用，對于及時追溯與控制傳染源，控制布病的流行也具有重要意義。

本文旨在探索利用布魯氏菌多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)的分子分型方法對布病的復(fù)發(fā)與重復(fù)感染來進(jìn)行鑒別。

1 材料與方法

1.1樣本及其病例基本信息 2014-2015年在北京某醫(yī)院收集了4例布病患者先后兩次發(fā)病后的血培養(yǎng)陽性樣本共8份。通過中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)以及醫(yī)院接診記錄收集病例的基本信息。

1.2主要試劑與儀器 Platinum PCR SuperMix(美國Invitrogen公司，貨號11306-016)，哥倫比亞血平板培養(yǎng)基(英國OXOID公司，貨號PB0123A)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；核酸自動電泳用卡夾(QIAxcel DNA Screening Kit)與QX Alignment Marker 15 bp/3 kb(德國QIAGEN公司，貨號分別為929004和929522),100 bp DNA Marker(美國NEB公司，貨號為N3231L)。

毛細(xì)管電泳儀QIAXCEL(德國QIAGEN公司)，iCycler普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)，數(shù)控干浴器AccuBlock(美國Labnet公司)，貨號為D1100。數(shù)字振蕩培養(yǎng)箱(美國Labnet公司)。

1.3菌株分離及其DNA制備 將血培養(yǎng)陽性樣本接種于哥倫比亞血平板，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h后，刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150 μL三餾水中，振蕩混勻制成菌懸液，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4布魯氏菌屬及種/型鑒定 采用BCSP31-PCR法進(jìn)行布魯氏菌屬的鑒定，采用AMOS-PCR法進(jìn)行布魯氏菌種/型的鑒定，引物序列及PCR方法參見文獻(xiàn)[8]。

1.5菌株的MLVA-16分型鑒定 共選取16個VNTR位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR引物序列及熒光標(biāo)記參見文獻(xiàn)[9]，具體見表1。采用二重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增各VNTR位點。反應(yīng)體系：8套二重PCR均采用25 μL反應(yīng)體系，其中Platinum PCR SuperMix預(yù)混液21 μL，2對混合引物(10 μm)2 μL，模板2 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 4 min，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 7 min延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行STR(short tandem repeat)檢測，確定片段大小，計算該片段的重復(fù)單元數(shù)。逐個計算菌株每個位點的串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目；將每個菌株的16個位點的串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目輸入到布魯菌MLVA數(shù)據(jù)庫http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/index.php中進(jìn)行比較，確定菌株基因型別。

2 結(jié) 果

2.14例病例的基本信息 見表2。

2.2菌株分離及其布魯氏菌屬及種/型鑒定結(jié)果 4個病例兩次發(fā)病的采樣時間及其血培養(yǎng)報陽時間見表3，血培養(yǎng)報陽后將培養(yǎng)物接種血平板分離培養(yǎng)3 d得到菌株。8株菌經(jīng)BCSP31-PCR擴(kuò)增后，均出現(xiàn)223 bp條帶,鑒定為布魯氏菌。擴(kuò)增結(jié)果見圖1。8株菌經(jīng)AMOS-PCR擴(kuò)增后，均出現(xiàn)178/731 bp大小的目的條帶，鑒定為羊種布魯菌。擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

表1 MLVA-16分型引物Tab.1 Primers for MLVA-16 genotyping

表2 病例基本信息Tab.2 Basic information of the cases

表3 病例兩次發(fā)病采樣時間與血培養(yǎng)報陽時間Tab.3 Sampling time and blood culture positive report time in two onset of the cases

S1-S8為編號S1至S8的菌株，M為NEB 100 bp Marker。圖1 S1-S8菌株BCSP31-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 BCSP31-PCR amplification results of S1-S8 strains

S1-S8為編號S1至S8的菌株，M為NEB 100 bp Marker。圖2 S1-S8菌株AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 AMOS-PCR amplification results of S1-S8 strains

2.3分離菌株的MLVA-16分型鑒定結(jié)果 8株菌按照每個位點上能夠擴(kuò)增出的基因片段大小及其重復(fù)片段的大小換算重復(fù)片段的個數(shù)見表。MLVA-16分型的Panel 1包括8個位點：Bruce06、08、11、12、42、43、45、55，Panel 2A包括3個位點：Bruce18、19、21，Panel 2B包括5個位點：Bruce04、07、09、16、30。結(jié)果顯示，變異最大的位點是Panel 2B的Bruce04，其次為Panel 1的Bruce43位點和Panel 2B的Bruce16位點。通過MLVA-16分型方法可將8株布魯氏菌分為7種不同的基因型，在數(shù)據(jù)庫中均不能找到完全對應(yīng)的基因型，故自定義為1-7型。按照Panel 1的結(jié)果分型可分為3種基因型：3個基因型均在數(shù)據(jù)庫中存在，分別為42(1-5-3-13-2-2-3-2，N=4)，63(1-5-3-13-2-3-3-2，N=2)，114(1-5-3-13-2-1-3-2，N=2)，各菌株16個位點的重復(fù)單元個數(shù)見表4。結(jié)果顯示，4個病例中有1例兩次發(fā)病時間間隔較短的患者的兩株分離菌株的MLVA-16分型完全一致，提示為復(fù)發(fā)。另外3例兩次發(fā)病時間間隔較長的病人前后兩次發(fā)病分離到的菌株的MLVA-16分型是不同的，分別各有一個位點的差異，其中兩位病人的差異在Bruce04位點，1例病人的差異在Bruce16位點。

表4 8株布魯菌分離株MLVA-16基因分型Tab.4 MLVA-16 genotyping of 8 Brucella isolates

3 討 論

在很多國家，布病都被認(rèn)為是重大公共衛(wèi)生問題。盡管該病的病死率極低，但嚴(yán)重威脅著動物飼養(yǎng)、獸醫(yī)、肉品加工等從業(yè)人員的身體健康，并給畜牧生產(chǎn)造成重大損失，還會影響旅游業(yè)及國際貿(mào)易的發(fā)展[10]。

人感染布魯氏菌可累及全身多個組織器官,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)肌肉疼痛等,急性期可以治愈,但不易被確診,常遷延為慢性感染,慢性期布病患者可有肝、脾及睪丸腫大,關(guān)節(jié)和脊柱強(qiáng)直,肌腱攣縮變硬等,很難治愈,如引起腦炎和心肌炎者可致命,嚴(yán)重影響人類健康[8]。由于布魯氏菌感染機(jī)體后特殊的免疫病理反應(yīng)，布病患者存在復(fù)發(fā)和重復(fù)感染的現(xiàn)象。而鑒別復(fù)發(fā)和重復(fù)感染，無論是對指導(dǎo)布病患者的治療，還是對布病患者的感染來源進(jìn)行追溯和管理都具有重要的意義。

目前臨床上布病的檢測主要使用血清學(xué)檢驗技術(shù)，診斷也主要依賴于血清抗體的檢測結(jié)果。但血清學(xué)檢測方法無法鑒別復(fù)發(fā)和重復(fù)感染，也無法對布病進(jìn)行病原學(xué)分型以及感染來源的追蹤溯源。人布魯氏菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是從感染者的血液或者其他臨床樣本中分離出布魯氏菌，對分離的病原進(jìn)行病原學(xué)特征的分析對病人的診斷具有重要意義。目前布魯氏菌的分型方法有很多種，各有優(yōu)缺點。MLVA分型由于具有快速、操作簡單、成本低廉、重復(fù)性好的優(yōu)點，可鑒別到生物型水平，且便于實驗室之間進(jìn)行比較等特點，使用較為廣泛。MLVA分型方法由Le Fleche等[11]提出，方案是對15個位點進(jìn)行分析。之后，Al-Dahouk等人在此基礎(chǔ)上增加了Bruce19位點[12]，將其調(diào)整為16個位點。其中Panel 1包括Bruce 06、08、11、12、42、43、45和55共8個位點，適用于布魯氏菌種間比較；Panel 2A包括Bruce 18、19和21共3個位點，Panel 2B包括Bruce 04、07、09、16和30共5個位點，Panel 2適合用于基因型的比較。

Garcia-Yoldi D等[13]研究認(rèn)為，MLVA是唯一一種能揭示布病暴發(fā)和確定儲存宿主的方法。該方法還可作為流行病學(xué)調(diào)查的工具，用來確定傳染源及傳播途徑，并找到菌株之間的關(guān)聯(lián)[14]，通過對菌株進(jìn)行聚類分析，得知感染來源是否相關(guān)[15]。本研究利用MLVA-16的分型方法對來源于4例先后兩次發(fā)病的布病患者的8株分離菌株進(jìn)行鑒定分析，探索該方法對布病復(fù)發(fā)和重復(fù)感染的鑒別診斷意義。

本研究首先采用BCSP31-PCR方法確定了8株分離菌株均為布魯氏菌；通過AMOS-PCR方法確定了其均為羊種布魯氏菌。再通過MLVA-16方法將收集到的8株菌株分為了7種基因型。沒有任何一株可以和布魯氏菌MLVA數(shù)據(jù)庫中的菌株相匹配。我們認(rèn)為這主要是由于數(shù)據(jù)庫中的大部分?jǐn)?shù)據(jù)都是由外國學(xué)者研究、上傳的。因不同地區(qū)，不同地域流行的布魯氏菌菌株不同，因此出現(xiàn)了基因型沒有對應(yīng)的情況，且從20世紀(jì)60年代中期至今，北京地區(qū)未曾系統(tǒng)開展布病細(xì)菌學(xué)方面的研究工作，布病的病原學(xué)資料為空白。因此確實存在北京地區(qū)布魯菌菌株和其他地區(qū)區(qū)別較大的可能。此外，沒有在數(shù)據(jù)庫中找到相對應(yīng)的菌株也從另一方面說明北京地區(qū)的布魯氏菌型別的分布和其他地區(qū)可能存在較大的區(qū)別[16]。

MLVA-16結(jié)果分析顯示，8株菌Panel 2B的Bruce04位點VNTR個數(shù)的變化最大，該位點多樣性最高，其分辨率也最高。其次是Panel 1的Bruce43和Panel 2B的Bruce16位點，而其他位點多樣性較低，這與很多研究結(jié)果一致[17-21]。1、3、4號患者于不同時間、兩次發(fā)病后分離的菌株S1和S2、S5和S6、S7和S8 6株菌株的MLVA-16分型均不同。S1和S2、S5和S6、S7和S8各分別相差1個位點，提示患者二次發(fā)病為重復(fù)感染，而非復(fù)發(fā)。而2號患者的前后兩次發(fā)病分離到的菌株MLVA-16分型完全一致，提示該患者的再次發(fā)病為復(fù)發(fā)，Kilic S.等人的研究也認(rèn)為同一患者初次發(fā)病與復(fù)發(fā)分離到的菌株，其MLVA-16的分型是一致的[22]。有研究顯示布病復(fù)發(fā)多發(fā)生在首次發(fā)病治愈后的半年之內(nèi)[6]，而2號患者兩次發(fā)病的時間間隔為112 d，在3～4個月之間，也提示其二次發(fā)病為復(fù)發(fā)而非重復(fù)感染。1、3、4號患者的二次發(fā)病時間分別為237、276和234 d，為8～9月左右，兩次發(fā)病的時間間隔較長，這也提示其二次發(fā)病為重復(fù)感染的可能性較大。有研究認(rèn)為首發(fā)布病以發(fā)燒、發(fā)冷、出汗、頭痛、頭暈癥狀為主，關(guān)節(jié)疼痛癥狀較輕，復(fù)發(fā)性布病的臨床癥狀則與前者相反[6]。也有學(xué)者認(rèn)為復(fù)發(fā)為布病的慢性化，而重復(fù)感染則為急性布病的表現(xiàn)，二者在實驗室檢查上很難做鑒別，但二者的臨床表現(xiàn)是有明顯不同的，臨床醫(yī)生需要對就診的布病患者進(jìn)行詳細(xì)深入的詢問，耐心細(xì)致的檢查，才會在相關(guān)的癥狀、體征上發(fā)現(xiàn)一些差別，從而做出鑒別[7]。本研究的結(jié)果表明，如果能夠從患者體內(nèi)分到病原，結(jié)合臨床表現(xiàn)，發(fā)病時間間隔、以及流行病學(xué)史等多方面的信息，對分離株的病原學(xué)特征進(jìn)行分析有助于對布病的復(fù)發(fā)和重復(fù)感染進(jìn)行鑒別診斷，MLVA-16分型方法對不同菌株之間的差異具有較高的分辨率，可作為布病復(fù)發(fā)和重復(fù)感染鑒別診斷的有效手段之一。

利益沖突：無