囊性包蟲病患者外周血PD-1在Treg細胞上的表達與Foxp3、TGF-β和IL-10的相關性研究

趙 慧,張峰波,朱玥潔,龐楠楠,安夢婷,李 斌,馬秀敏,丁劍冰，

細粒棘球蚴病又稱囊性包蟲病(cystic echinococcosis，CE)，是由細粒棘球絳蟲所致的最為常見的人獸共患病，是新疆、青海、西藏等農牧地區的高發疾病[1]。雖大部分CE患者可通過手術和藥物進行治療，但依舊存在術后復發、藥物耐受和部分不良反應等問題，治療效果不理想[2-5]。共刺激分子程序性死亡受體 1(programmed death 1，PD-1)是近年發現的免疫抑制分子，因在免疫耐受中發揮重要作用而被人們逐漸重視[6]。研究發現PD-1參與抑制調節T細胞、NK細胞和樹突狀細胞等多種免疫細胞的功能，且在腫瘤和病毒感染等疾病中通過抑制效應細胞發揮作用，從而促進疾病的發展[7-9]。調節性T細胞(regulatory T cell，Treg或Tr)是一群能識別靶細胞MHC分子所提呈的TCR-抗原肽，并發揮一定免疫抑制功能的T細胞。通過抑制效應T細胞的活化增殖達到機體的免疫耐受和預防自身免疫性疾病的作用。這類細胞以表達Foxp3、CD25、CD4為細胞表型特征，通過分泌具有抑制作用的細胞因子TGF-β和IL-10發揮其功能[10-13]。在過去20年內，研究已經證實了Treg細胞在感染、腫瘤、器官移植、同種異體胎兒免疫相關疾病方面具有抑制各種途徑的病理生理免疫應答的作用[14]。然而，Treg細胞的抑制作用也同時促進了感染、腫瘤等疾病的發生發展[15]。

本研究欲采用流式細胞術(FCM)檢測CE患者外周血中Treg細胞上PD-1的表達，通過熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)法檢測CE患者外周血單個核細胞(PBMCs)中PD-1 mRNA和Treg細胞轉錄因子Foxp3 mRNA的表達，用ELISA法檢測CE患者血清中Treg細胞相關細胞因子TGF-β和IL-10的水平，進一步探討負性共刺激分子PD-1與Treg細胞在該疾病中的關系和作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究涉及的所有實驗內容均征得CE患者和對照人群的知情同意，研究已通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理學委員會批準。研究對象由CE患者和對照人群組成。CE患者30例，為2017年1月至2017年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院消化血管外科中心肝膽包蟲外科住院的確診患者(根據B超分型，均為活動性CE1-CE3患者)，其中男性18例，女性12例，平均年齡44±13.42歲。CE患者經臨床表現及體征、免疫學檢查、B超和CT檢查進行確診，所有患者均為初次手術，且無慢性感染病、先天性肝囊腫、膽囊積液等其他肝膽系統疾病；對照組30例為體檢人群，其中男性16例，女性14例，平均年齡41±10.21歲，均排除慢性感染、右側腎盂積水、細菌性肝膿腫、先天性肝囊腫、膽囊積液、先天性膽總管囊型擴張癥等肝膽系統疾病及其他重大疾病。

1.1.1標本采集 30例CE患者和30例對照人群均空腹8 h后采集EDTA抗凝血5 mL和不抗凝血3 mL。EDTA抗凝血為FCM檢測和QRT-PCR檢測用。不抗凝血經3 000 r/min 離心5 min(德國eppendorf -5415R)，吸取血清于EP管中，-20 ℃凍存待ELISA檢測用。

1.2 方 法

1.2.1FCM法檢測外周血PD-1+CD4+CD25+Treg細胞的百分比 將30例CE患者和30例對照人群的外周血放置于流式管中，裂解紅細胞，制備單細胞懸液，用臺盼藍染色計活細胞數>95%，分別加入流式抗體(美國BD公司)CD3-APC 2 μL、CD4-Percp 2 μL、PD-1-PE 2 μL、CD25-Pecy7 2 μL，室溫避光孵育20 min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用PBS重懸細胞，調整細胞數為2×106/mL，用流式細胞儀(德國美天旎生物技術有限公司)檢測。

1.2.2QRT-RCP法檢測外周血PBMCs中PD-1 mRNA和Foxp3 mRNA的含量。

1.2.2.1設計引物 從GenBank獲取人PD-1和Foxp3基因全序列，用VectorNTIsulte7.0軟件包對獲取的人的各基因序列進行比對分析，選取相對保守、同源性高的區域應用Primer5.0進行引物設計，以β-actin作內參照(表1)。

表1 PD-1、Foxp3和β-actin基因引物序列Tab.1 Gene primers sequence of PD-1、Foxp3and β-actin

1.2.2.2人全血DNA的提取 所有用品均嚴格按消除RNase的常規方法處理，玻璃及金屬器皿在250 ℃烘烤4 h，塑料器皿用DEPC溶液浸泡24 h，高壓滅活DEPC后烤干備用。采集CE患者和對照人群外周血，分離外周血PBMCs并保存于液氮中作進一步分析。用Trizol-LS試劑(Invitrogen，Life Technologies，美國)從PBMCs中提取總RNA，用M-MLV逆轉錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)反轉錄成cDNA。提取的cDNA用Smartspec3000型紫外分光光度計測定濃度和純度。

1.2.2.3目的基因檢測 采用SYBR-GREEN-PCR預混料(中國大連TaKaRa生物技術有限公司)按照制造商的方案進行QRT-PCR(美國BIO-RAD公司)。擴增目的基因和內參基因β-actin。反應條件：50 ℃ 2 min(UDG孵育)，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。用2-ΔCt對靶基因進行Ct值量化。重復實驗至少3次。

1.2.3ELISA法檢測血清中TGF-β和IL-10的水平 檢測CE患者和對照人群血清中TGF-β和IL-10的水平。檢測按照ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀(美國BIO-RAD公司)450 nm處讀吸光度(OD)值，根據標準曲線計算濃度。

2 結 果

2.1CE患者和對照人群中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞的表達 通過流式細胞術檢測CE患者和對照人群中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞的表達分別為(34.03±5.97)%和(12.82±3.92)%；與對照人群相比，CE患者PD-1+CD4+CD25+Treg細胞(P=0.000)的表達均增高(圖1)。

注：①P<0.001圖1 外周血中PD-1+CD4+CD25+ Treg細胞的比例Fig.1 Ratio of PD-1+CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood

2.2CE患者和對照人群中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達 通過熒光定量PCR檢測CE患者和對照人群中PD-1 mRNA含量的表達分別為4.79±0.95和1.03±0.4； Foxp3 mRNA含量的表達分別為17.92±2.66和8.36±2.29。與對照人群相比，CE患者中PD-1(t=18.35，P=0.000)和Foxp3 mRNA(t=14.89，P=0.000)含量均顯著增高(P<0.01)(圖2)。

注：①P<0.001圖2 外周血單個核細胞中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達Fig.2 The mRNA expression of PD-1 and Foxp3in peripheral blood mononuclear cells

2.3CE患者和對照人群中TGF-β和IL-10水平的表達 通過ELISA法檢測CE患者和對照人群血清中TGF-β水平的表達分別為15.10±2.35和9.76±1.53；IL-10水平的表達分別為19.81±3.36和10.02±2.31。與對照人群相比，CE患者TGF-β(t=10.43，P=0.046)和IL-10(t=13.13，P=0.000)水平的表達均增加(P<0.05)(圖3)。

注：a)The levels of TGF-β in sera; b) The levels of IL-10 in sera圖3 血清中TGF-β 和 IL-10水平的表達Fig.3 Levels of TGF-β and IL-10 in sera

2.4 相關性分析

2.4.1CE患者外周血中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表達的相關性 通過Pearson法分析CE患者外周血中PD-1mRNA及Treg細胞轉錄因子Foxp3 mRNA表達的相關性發現，CE患者外周血PD-1 mRNA的表達均與Foxp3 mRNA表達水平呈正相關(r=0.602，P<0.01)(圖4)。

2.4.2CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞與血清中TGF-β和IL-10水平的相關性 通過Pearson法分析CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞的表達及血清中TGF-β和IL-10的相關性發現，CE患者外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞與TGF-β(r=0.477，P<0.01)和 IL-10(r=0.825，P<0.01)的水平均呈正相關(圖5)。

圖4 PD-1 mRNA與Foxp3mRNA的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of PD-1 mRNA and Foxp3 mRNA

注：a) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β; b) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and IL-10圖5 外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg細胞和TGF-β、IL-10水平的表達的相關性Fig.5 Correlation analysis of PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β、IL-10

3 討 論

細粒棘球蚴感染會逐漸形成慢性感染，傳統治療方法如手術清除和藥物治療都難以有效根除感染。前期研究發現細粒棘球蚴病不斷發展成為慢性化感染的一個主要原因是機體細胞免疫功能紊亂，導致免疫失衡現象明顯，表現為機體不能有效清除病原體，且向有利于細粒棘球蚴感染的方向發展[16]。臨床試驗和動物實驗結果均顯示，人和小鼠感染棘球蚴后體內CD4+T細胞起到了主要免疫調節作用，不同輔助性T細胞亞群發揮了各自的功能。其中有以Th1和Th17細胞為主的抗感染免疫，也有以Th2細胞為主的抑制性免疫[17-19]。本研究結果顯示，CD4+T細胞中一組重要亞群Treg細胞在細粒棘球蚴感染中也發揮了重要作用，且可能與負性共刺激分子PD-1的高表達相關。

目前普遍認為Treg細胞可通過分泌具有抑制作用的細胞因子TGF-β和IL-10發揮功能[20]。本研究結果顯示在CE患者中，Treg細胞的轉錄因子Foxp3水平明顯升高，同時相關細胞因子TGF-β和IL-10的水平也顯著增高，這均說明在CE患者中Treg細胞發揮了作用。正常機體內Treg細胞的存在是為了抑制效應T細胞的活化增殖達到機體的免疫耐受和預防自身免疫性疾病的發生。一旦發生感染、腫瘤等疾病，機體會產生大量效應T細胞通過分泌炎性因子等對病原體進行清除[21]。與此同時，Treg細胞也會相應大量增殖，控制炎性因子等對機體的病理損害。然而這種關系一旦發生失衡，Treg細胞的抑制作用會不利于疾病的控制，并促進感染的發展[22]。因此，推測Treg細胞及其相關因子的免疫抑制作用使細粒棘球蚴發生免疫逃避，從而促進感染的持續性發展，甚至可能與術后感染復發和藥物耐藥有關。

另本研究發現CE患者外周血中PD-1在Treg細胞表面的表達顯著增加。研究發現PD-1/ PD-L1通路可通過TGF-β誘導人外周血T淋巴細胞向Treg細胞分化，從而促進腫瘤的發生[23]。另PD-1的高表達與腫瘤浸潤性Treg細胞的增加和效應T細胞的減少有關，阻斷PD-1可有效增強抗腫瘤免疫[24]。本研究發現Treg細胞上PD-1的表達與其特異性轉錄因子Foxp3及相關細胞因子TGF-β和IL-10均呈正相關，由此考慮在CE患者中PD-1對Treg細胞的生成起誘導促進作用。推測其通過促進其轉錄因子Foxp3的表達，促進Treg細胞的增殖，從而促進TGF-β和IL-10的分泌。研究認為活化的Treg細胞表達PD-1，并且有可能通過PD-1/ PD-L1途徑發揮效應機制。用PD-L1抗體封閉PD-1/ PD-L1通路可阻斷Treg細胞的抑制功能，恢復效應T細胞的增殖[25]。因此CE患者中Treg細胞表面PD-1表達的增加提示負性共刺激分子PD-1與該疾病有關，且參與細粒棘球蚴感染中Treg細胞介導的抑制性免疫。另PD-1與其配體PD-L1結合后，可使效應T細胞功能受損[9,27]，故推測PD-1可協同Treg細胞增強該疾病的免疫逃避作用，加重感染進程和慢性化的發展。

綜合分析，本研究考慮CE患者中負性共刺激分子PD-1的表達與Treg細胞轉錄因子Foxp3和相關細胞因子TGF-β和IL-10相關。Treg細胞上PD-1的高表達會促進Treg細胞的生成及細胞因子TGF-β和IL-10的產生，且PD-1與Treg細胞共同參與細粒棘球蚴感染的免疫逃避過程，從而促進感染的持續性發展。其具體機制待進一步深入研究。機體免疫細胞種類繁多，作用機制復雜。因此，深入研究細粒棘球蚴感染的免疫機制，對進一步設計有效控制感染的免疫治療方法至關重要。

利益沖突：無