一起巴西龜引起幼兒長灣泥沙門菌感染的調(diào)查研究

童 晶，吳畏畏，張傳皊，郭 惠，鄭東宇

長灣泥沙門菌于1955首次報道[1]，國內(nèi)于2016年才首次有檢出報道[2]，是腹瀉人群中較罕見病原菌型。相關(guān)文獻中有10起長灣泥沙門菌感染都與寵物烏龜接觸有關(guān)[3]。2018年9月于徐州市兒童醫(yī)院1例出血性腹瀉幼兒的血液標本中檢出長灣泥沙門菌(SalmonellaJangwani,17∶a∶1.5),系江蘇地區(qū)首次檢出。隨后，對患兒進行流行病學(xué)調(diào)查和暴露因素病原學(xué)檢索，對陽檢菌株的生物學(xué)特征和分子流行病學(xué)特征進行研究，為感染溯源提供生物學(xué)證據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1病例標本 2018年9月10日徐州市兒童醫(yī)院住院收治出血性腹瀉幼兒1例，采集1份靜脈血5 mL和1份血樣大便3 g。

1.1.2暴露因素樣本 2018年9月27日采集患兒家中嬰兒奶粉，米粉，薯片各1份(50 g/份)，餐具涂抹樣2份(100 cm2/份)，巴西龜糞便1份，巴西龜殼和容器涂抹標本各1份(100 cm2/份)，共計8份標本進行病原學(xué)檢測。并于10月、11月連續(xù)進行龜糞便、龜容器、龜殼采樣，共采集標本6份。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1儀器 ATB Expression 自動細菌鑒定儀由法國梅里埃公司提供；CHEF-mapper型脈沖場凝膠電泳儀及配套設(shè)備為美國伯樂公司；美華MA120鑒定藥敏分析系統(tǒng)為珠海美華公司提供。

1.3 方 法

1.3.1流行病學(xué)調(diào)查 及時查閱患兒就診記錄和跟蹤回訪，對高危因素進行連續(xù)跟蹤調(diào)查監(jiān)測。

1.3.2病原學(xué)檢測 按照《GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門菌檢驗》、《全國食源性疾病監(jiān)測工作手冊》進行沙門菌的分離、鑒定、血清學(xué)分型等病原學(xué)表型檢測。

1.3.3抗生素敏感性試驗 采用國家致病菌識別網(wǎng)推薦的微量肉湯稀釋法檢測沙門菌對27種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。抗生素包括：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺異惡唑、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、多粘菌素E、多粘菌素B、米諾環(huán)素、阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、美羅培南、左氧沙星、多西環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素。標準質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922作為藥敏試驗質(zhì)控菌。操作、質(zhì)量控制、結(jié)果判讀均嚴格按照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI M100-S27)抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(2017年)執(zhí)行。

1.3.4PFGE 分型方法 參照國家致病菌識別網(wǎng)技術(shù)手冊(分子分型實驗篇)標準操作程序進行XbaⅠ和BlnⅠ雙酶切PFGE，結(jié)果采用BioNumerics(Applied—maths公司ver6.6)進行分析處理，采用UPGMA法進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

2.1.1臨床表現(xiàn)及診治過程 患兒，男，1歲3個月，2018年9月4日發(fā)病，以黃色、粘液便為主，5～6次/d，無發(fā)熱、嘔吐，給予蒙脫石散，媽咪愛對癥治療，效果差。9月8日，發(fā)熱38.7 ℃，血便，遂至當?shù)劓?zhèn)醫(yī)院輸液治療，出現(xiàn)大量血便，后轉(zhuǎn)入徐州市兒童醫(yī)院住院治療。入院各項檢查指征為：超敏C反應(yīng)蛋白49.23 mg/L；白介素-6:13.25 pg/mL；血常規(guī):白細胞7.62×109/L,紅細胞4.44×1012/L,血紅蛋白113 g/L,中性細胞比率50.2%，淋巴細胞比率37.5%，單核細胞比率12.2%。大便常規(guī)：RBC 6～8/HP,WBC 20～25/HP,潛血++。其余各項未見明顯異常。患兒血培養(yǎng)顯示腸沙門氏菌亞種。予頭孢曲松聯(lián)合哌拉西林/他唑巴坦抗感染治療，好轉(zhuǎn)。

2.1.2感染來源調(diào)查 回顧性家訪調(diào)查確認，患兒以人工喂養(yǎng)、奶粉喂養(yǎng)為主，輔以薯片和米粉，近期家庭其他成員無不適，患病前1周無外出就餐和旅游史。家中飼養(yǎng)1只巴西龜1年余，經(jīng)常有龜殼接觸史。

2.1.3連續(xù)跟蹤隨訪 根據(jù)調(diào)查結(jié)果，告知患兒家長做好隔離防護，避免患兒再次接觸巴西龜和其他高危因素，2018年9-11月隨訪期間，患兒未曾出現(xiàn)二次感染，期間每個月采集巴西龜樣品進行監(jiān)測。

2.2 病原學(xué)檢測

2.2.1病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果 在患兒發(fā)病6 d后，收治住院的2份患兒標本中，僅在血培養(yǎng)中檢出1株長灣泥沙門菌，患兒血便中未有檢出。在食品、餐具、龜糞等共計14份暴露因素樣品中有4份樣品檢出長灣泥沙門菌。在新鮮龜糞和龜殼涂抹樣品中有檢出，詳見表1。

表1 長灣泥沙門菌暴露因素樣本連續(xù)監(jiān)測結(jié)果Tab.1 Results of continuous monitoring in samples of Salmonella Jangwani exposure factors

2.2.2生化表型鑒定 5株陽檢菌在科瑪嘉沙門菌顯色平板36 ℃培養(yǎng) 24 h，呈現(xiàn)紫紅色、圓形濕潤的菌落特征；經(jīng)革蘭染色鏡檢見革蘭陰性無芽孢桿菌；挑選選擇性平板生長的疑似典型菌落接種于雙糖鐵瓊脂，36 ℃培養(yǎng) 24 h，結(jié)果為斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸(K/A)，產(chǎn)氣，H2S+。經(jīng)API 20 E進行系統(tǒng)生化鑒定，生化編碼為6705752，鑒定結(jié)果為沙門菌屬(id=99.9%)。5株菌株生化譜完全一致，結(jié)果見表 2。對血液來源菌株，同時用vitek GN板條進行驗證，鑒定結(jié)果一致，生物編碼為00176105455666(95%概率)。

2.2.3血清學(xué)鑒定結(jié)果 5株菌株分別用寧波天潤沙門菌血清進行初步鑒定，然后用丹麥 SSI 沙門菌血清進行復(fù)核。根據(jù) Kauffman-White 血清分型標準，血清型別判定為長灣泥沙門菌血清型(SalmonellaJangwani，17∶a∶1，5)。經(jīng)江蘇省疾病預(yù)防控制中心用丹麥SSI沙門菌血清復(fù)核鑒定結(jié)果為符合。

2.2.4藥敏試驗結(jié)果 本次分離的5株長灣泥沙門菌，4株菌的耐藥譜100%一致，僅對頭孢唑啉耐藥有差異：18-Q4-4為中介，其它4株菌株為耐藥。5株菌均對磺胺異惡唑耐藥，對四環(huán)素中度耐藥，對其他25種藥物均敏感，詳見表3。

表2 長灣泥沙門菌API 20E生化譜Tab.2 Biochemical Spectrum of Salmonella Jangwani API 20E

表3 5株長灣泥沙門菌藥敏實驗結(jié)果Tab.3 Result of drug sensitivity test of 5 strains of Salmonella Jangwani

2.2.5PFGE分型結(jié)果 5株沙氏菌經(jīng)XbaⅠ和BlnⅠ雙酶切，帶型相似度均達到100%，提示不同來源的長灣泥沙門菌均來自1個生物克隆，患兒分離株與龜糞便株高度同源，見圖1。

3 討 論

長灣泥沙門菌感染在2016年和2017年分別在浙江和北京有相關(guān)報道[2，4]，江蘇及周邊地區(qū)未見相關(guān)研究。本次分離到的長灣泥沙門菌在徐州地區(qū)為首次檢出。浙江和北京病例未對病原菌傳播進行溯源或未能溯源到，而本研究中對病人分離株和巴西龜寵物分離株實現(xiàn)了良好的生物學(xué)溯源。巴西龜和患兒樣品中檢索的長灣泥沙門菌生物表型特征高度一致，PFGE分型分析表明，不同來源的分離株來自于同一生物克隆，提供了有力的分子流行病學(xué)證據(jù)。同時流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論也一致支持巴西龜為患兒長灣泥沙門菌感染的來源。

在90年代初期，國外研究人員已經(jīng)從外來寵物感染沙門菌案例中分離出包括乙型副傷寒爪哇變種、斯坦利、浦那、長灣泥、利奇菲爾德、曼哈頓、波摩那、邁阿密等多種沙門菌血清型[5]。爬行動物成為人感染沙門菌的主要來源，其糞便帶菌率超過90%[6]。本研究連續(xù)監(jiān)測證實，巴西龜作為傳染源可以連續(xù)帶菌，但是病原菌在體外存活能力不強，在陳舊龜糞中未有檢出。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，患兒年齡較小，經(jīng)常接觸寵物龜，對于接觸后是否及時洗手或是直接飲食，家長未能及時關(guān)注，因此發(fā)病初期可能存在二次感染，從而使患兒出現(xiàn)繼發(fā)感染——菌血癥。當病家意識到巴西龜?shù)奈：螅龊酶綦x，隨訪3個月期間患兒未曾二次感染。寵物巴西龜由于飼養(yǎng)方便，受到很多兒童家庭的喜愛，但是外來寵物物種有病原感染風(fēng)險，需引起眾多兒童家庭的重視。

本次分離到的長灣泥沙門菌常用抗菌藥物尚保持敏感,對磺胺類藥物耐藥，故患兒在使用頭孢曲松聯(lián)合哌拉西林/他唑巴坦抗感染治療后，效果明顯。提示相關(guān)感染防治重點是關(guān)注傳染源，做好二次感染防護。

圖1 5株不同來源長灣泥沙門菌雙酶切PFGE聚類分析圖譜Fig.1 PFGE cluster analysis of 5 strains of Salmonella Jangwani from different sources

爬行動物的腸道適合某些沙門菌定植，多種沙門菌血清型陸續(xù)從巴西龜、蜥蜴等寵物中分離到[7]，流行病學(xué)調(diào)查也表明感染者曾接觸過此類動物，因此，沙門菌的感染高危人群，即免疫力低下者、老人、幼兒或嬰幼兒看護人員，應(yīng)避免接觸此類爬行動物。而一些寵物售賣者或批發(fā)商在寵物預(yù)防性治療上，開始使用抗生素，促使沙門菌耐藥克隆的增加，從而導(dǎo)致在人類疾病出現(xiàn)時，不再對抗生素治療有效或出現(xiàn)沙門菌重癥感染，從而引發(fā)新型耐藥菌型的出現(xiàn)。由于我國對爬行類動物攜帶感染人的致病菌的研究尚不豐富，因此，需要警覺該類傳染病的潛在上升趨勢和被低估的可能。

本研究中，由于病家巴西龜購買時間過久，未能溯查到巴西龜?shù)匿N售來源，因此其他購買者的家庭是否也有感染病例出現(xiàn)，是否去醫(yī)院就診不得而知。另外，此次調(diào)查涉及的標本量較少，時間尚短，因此，以后研究需要加大對爬行類寵物感染人的病原學(xué)監(jiān)測，收集更全面的數(shù)據(jù)，為新發(fā)傳染病的防控提供基線預(yù)警資料。

利益沖突：無