噬菌體Chy5的生物學(xué)和基因組學(xué)特征

江莉莎，劉 平，鄔亭亭，郭述良

結(jié)核病的傳播在全球范圍內(nèi)愈演愈烈，特別是耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)更加劇了疫情流行。噬菌體在結(jié)核病的診斷和治療上已得到了多方面的應(yīng)用。在結(jié)核病診斷方面，熒光報告噬菌體(LRP)已逐步應(yīng)用于結(jié)核菌及其耐藥性檢測[1-3]。但國內(nèi)研究均以現(xiàn)有的熒光報告噬菌體為基礎(chǔ)做擴(kuò)展探究，尚無自行構(gòu)建熒光報告噬菌體的報道。現(xiàn)有的熒光報告噬菌體多以噬菌體TM4、D29、L5、Che12為基礎(chǔ)。其中，利用噬菌體TM4、D29構(gòu)建的熒光報告噬菌體會殺死宿主菌，而死菌無法發(fā)出熒光，導(dǎo)致其敏感度較低；L5、Che12因?yàn)槠淙茉葱允删w的特性，其熒光報告噬菌體敏感度較高，但仍需104/mL結(jié)核菌才能檢測到熒光[1,4]。另外上述噬菌體均已注冊專利，對后續(xù)研究及專利申請不利。因此，不斷篩選新的能感染結(jié)核分枝桿菌的溶源性噬菌體，并完成基因測序，仍是噬菌體研究者十分重要的基礎(chǔ)工作，以期構(gòu)建出敏感度更高的熒光報告噬菌體。

1 材料與方法

1.1菌株 恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis, MS)mc2155(CMCC 93202)由中國藥品生物制品檢定所王國治教授饋贈。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(CMCC93004)由重慶市肺科醫(yī)院饋贈。分枝桿菌臨床株36株由重醫(yī)一院患者痰標(biāo)本中分離得到，利用羅氏藥敏培養(yǎng)基(珠海貝索公司)完成菌種和藥敏鑒定。

1.2噬菌體的分離 取5 g土壤樣本，用10 mL 噬菌體緩沖液浸泡30 min，使噬菌體充分進(jìn)入緩沖液中，4 500 g 離心10 min，小心吸取上清液，0.22 μm濾器過濾除菌。取1 mL上清液與1 mL恥垢分枝桿菌混合，再加入8 mL 7H9液體培養(yǎng)基(BD，美國，含10% ADC)，混合均勻，在恒溫振蕩器中(37 ℃，160 r/min)震蕩培養(yǎng)過夜，離心收集上清液，并用0.22 μm過濾器過濾除菌。將100 μL的過濾液和1 mL的恥垢分枝桿菌菌液充分混勻后室溫靜置15 min，再加入3 mL 7H9固體培養(yǎng)基(BD，美國)，混勻后平鋪于7H10固體培養(yǎng)基(BD，美國)平板上。倒置培養(yǎng)24 h。收集到典型的噬菌斑后再純化5代。根據(jù)噬菌體分離地點(diǎn)及樣本序列號，將噬菌體命名為Chy5。

1.3噬菌體電鏡觀察 取20 μL電純化的噬菌體液，滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min，用濾紙從側(cè)面吸去多余的液體，再加20 μL 2%磷鎢酸于銅網(wǎng)上，染色10 min，待其自然干燥，并在透射電鏡(Hitachi-7500, 日本)下觀察噬菌體形態(tài)。

1.4噬菌體宿主譜 利用單斑法[5]測定宿主譜。將稀釋的各宿主菌(各結(jié)核臨床株及標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv)分別制成均勻的菌苔。再在各菌苔上滴加5 μL噬菌體樣液，待其晾干后倒置于 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果至6周后。(陽性：有噬菌斑形成，陰性：無噬菌斑形成；陽性對照組為恥垢分枝桿菌。)

1.5基因組測序及生物信息學(xué)分析 用λ噬菌體DNA 提取試劑盒(北京艾根比公司)，按操作說明提取噬菌體Chy5的 DNA。噬菌體DNA的全基因組測序采用鳥槍法由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。得到的序列用Phred/PhraD/Consed軟件包組裝、拼接成若干個重疊群，各重疊群間的缺口通過設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增連接，得到完整的全基因組序列。用DNAStar軟件包分析基因組組成成分；用Glimmer3.0、GeneMark軟件對基因組序列作基因預(yù)測，所得結(jié)果互相補(bǔ)充。為完成噬菌體的基因組比較，將噬菌體基因與公共數(shù)據(jù)庫基因作blast m8比對，e-value <= 1e-5，選取每個蛋白的最好比對結(jié)果，將兩兩比對均是最好的結(jié)果保留，然后用perl語言，生成svg的共線性圖。

1.6噬菌體Chy5溶源菌的分離 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，用無菌接種環(huán)蘸取Chy5噬菌斑中幾乎清晰透明的區(qū)域，在一塊新的7H10固體培養(yǎng)基平板上接種劃線，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，直至某塊平板上有菌落長出，即認(rèn)定為Chy5溶源菌。

1.7紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn) 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，從7H10固體培養(yǎng)基上挑取Chy5溶源菌菌落，置于7H9液體培養(yǎng)基中重懸。取500 μL混懸菌液，在30 W的紫外燈(間距50 cm)下照射30 min，再和500 μL恥垢分枝桿菌菌液及2 mL 7H9固體培養(yǎng)基混合，平鋪于7H10下層平板上冷卻凝固，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。以恥垢分枝桿菌為對照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.8噬菌體超免反應(yīng) 參照Vanaja Kumar的實(shí)驗(yàn)方法[1]，將Chy5溶源菌與7H9固體培養(yǎng)基充分混勻，鋪于7H10下層平板上冷卻凝固，制成菌苔。分別取10 μL 10倍梯度稀釋的Chy5、D29、Leo噬菌體液點(diǎn)涂于菌苔上，并標(biāo)記斑點(diǎn)位置，倒置在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。以恥垢分枝桿菌為對照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1噬菌體分離及噬菌斑形態(tài) 我們以恥垢分枝桿菌為宿主菌，在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)核病區(qū)分離得到噬菌體Chy5。噬菌體Chy5在最初24 h形成透明、圓形的噬菌斑，但繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，噬菌斑逐漸變渾濁。

2.2電鏡觀察 噬菌體Chy5由頭部和尾部組成。頭部為對稱的多面體結(jié)構(gòu)，直徑(61.5±1.4) nm，尾部可彎曲、不可收縮，長度(114.1±2.1) nm。迄今發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌噬菌體均為有尾噬菌體；其中大部分具有可彎曲、不可收縮的長尾，稱為長尾噬菌體；小部分僅有不可收縮的短尾，稱為肌尾噬菌體[6]。因此，噬菌體Chy5屬于長尾噬菌體。

注：白色箭頭指示噬菌體尾部，黑色箭頭指示噬菌體頭部。圖1 噬菌體Chy5電鏡圖(×60 000)Fig.1 Electronmicrogragh of phage Chy5

2.3噬菌體宿主譜 噬菌體Chy5可感染結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，對臨床結(jié)核敏感菌感染率可達(dá)100%。除廣泛耐藥菌外，對耐多藥及多耐藥結(jié)核菌的感染率在85%以上。同時，噬菌體Chy5還能感染部分牛結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，見表1。

2.4 噬菌體基因組測序及生物信息學(xué)分析

2.4.1基因組組成成分分析 Chy5基因組全長51 214 bp，G+C含量63.60%，有3種起始密碼子，分別是ATG (n=52), GTG (n=27) 和TTG (n=10)。

表1 噬菌體Chy5宿主譜Tab.1 Host range of phage Chy5

2.4.2基因組功能預(yù)測分析 經(jīng)軟件預(yù)測，Chy5有88個推定基因，大部分與噬菌體D29所對應(yīng)的基因相似，其中有30個基因有推測功能，如表2。按基因功能，主要分為3大類，裂解元件、整合元件以及病毒結(jié)構(gòu)和聚集基因。

噬菌體Chy5的裂解元件由裂解酶A、裂解酶B和Holin蛋白組成，其中ORF 6與D29的裂解酶A相似度99.8%，ORF 7與D29的Holin蛋白相似度100%，ORF 8與D29的裂解酶B相似度99.21%。

噬菌體需將其基因組整合到宿主菌的染色體中，才能產(chǎn)生溶源現(xiàn)象[7]。據(jù)溶源性噬菌體L5的研究表明，attP位點(diǎn)和整合酶在此過程是必不可少的[7-8]。除此之外，要維持溶源現(xiàn)象的穩(wěn)定，基因組中必須存在有活性的阻遏蛋白[9]。Chy5 ORF 31與D29的整合酶相似度82.58%，推定其編碼整合酶。attP位點(diǎn)通常位于整合酶的下游，且與宿主菌tRNA中的某一段(attB位點(diǎn))重合[10]。因此，利用NCBI的BLASTN功能，對ORF 31(即整合酶)下游區(qū)域和結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組作比較，發(fā)現(xiàn)一段核酸序列(26973-27013bp)與H37RV基因組中tRNA-Gly基因中某片段(2765541-2765611bp)完全重合，即為attP位點(diǎn)，如圖2。另外，ORF 70推定為編碼阻遏蛋白的基因，但Chy5 ORF 70與噬菌體Pukovnik的阻遏蛋白相似度僅70.82%，是否具有活性，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

病毒結(jié)構(gòu)和聚集基因位于基因組的左臂，共13個。其中ORF 23編碼卷尺蛋白，與噬菌體尾部長度相關(guān)[11]。

表2 噬菌體Chy5基因注釋Tab.2 Gene annotation of phage Chy5

402974631569-60768.19ATGDNA polymerase413157731912-11112.11ATG423232232528-687.88ATG433191232322-13615.3ATGHTH_Hin_like443253133238-23526.53ATGRP thymidylate synthase453330633884-19220.33TTG463389635788-63070.04ATGribonucleotidereductase473597736174-657.37GTG483617136356-617.06ATG493704437196-506.06TTG503634037047-23526.41TTG513720037967-25528.55GTGphosphoesterase523796038415-15117.38GTG533841238684-9010.22ATGThioredoxin543868439316-21023.68TTGRP primase/helicase553953039949-13915.93GTGRecombination endonuclease VII563997840121-474.97ATG574011840954-27829.81ATGAbhydrolase/ Esterase_lipase584095141343-13014.58TTG594132841483-515.84GTG604148041716-788.86ATG614187942265-12813.99ATG624229742947-21623.52TTGP-loop_NTPase /RecA-like_NTPases634302743173-485.49GTG644317043769-19922.88GTG654376643906-465.31GTG664390344136-778.7ATG674417744419-809.46ATG684446745276-26930.86GTGRecB-like nuclease694527345692-13915.71ATG704574846242-16419.08ATGrepressor714648946647-525.85GTG724664446916-909.84ATG734714047274-444.93GTGnovel NTPase744691347143-768.76GTG754727447552-9210.19ATG764755248325-25728.94ATG774832848465-455.48ATG784847648679-677.2ATG表2(續(xù))ORFStartStopStrandSize(aa)MW(kDa)Start codonPredicted Function794868948817-425.13GTG804881449080-889.59ATG

814911449476-12013.7ATGParB-like nuclease824950349883-12614.21ATG835000850121-374.13GTG844988050011-435.07GTG855010050294-646.89GTG865030950575-8810.09ATG875057850742-546.21GTG885075051202-15016.94ATG

圖2 噬菌體Chy5基因組的attP位點(diǎn)Fig.2 attP site of phage Chy5 genome

2.4.3共線性分析 與Chy5基因組最相似的噬菌體是D29 和Pukovnik，尤其是D29，如圖3。各基因高度同源，共線性清晰，提示Chy5為A簇噬菌體。

圖3 噬菌體Chy5基因共線性分析Fig.3 Colinearity analysis of the genes of phage Chy5

2.5紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn) 將分離得到的Chy5溶源菌在紫外線下照射30 min后，再將其與恥垢分枝桿菌共培養(yǎng)過夜，平板上可見噬菌斑形成。而以野生型恥垢分枝桿菌為對照組重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，則沒有噬菌斑。上述結(jié)果表明Chy5為溶源性噬菌體，可形成溶源菌。

2.6超免反應(yīng) 與對照組相比，Chy5幾乎無法在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑；D29在高滴度時可在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑，但在低滴度時亦無法形成清晰的噬菌斑。而Leo在任何滴度下均可在Chy5溶源菌及恥垢分枝桿菌菌苔上呈現(xiàn)清晰的噬菌斑(圖4)。

注：噬菌體滴度從左到右依次為107、106、105、104 PFU/mL圖4 噬菌體Chy5超免反應(yīng)Fig.4 Superinfection immunity of phage Chy5

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分離到一株噬菌體，命名為Chy5。其噬菌斑在48 h后變渾濁，提示其可能為溶源性噬菌體。電鏡觀察噬菌體顆粒形態(tài)，見其尾部可彎曲、不可收縮，長度(114.1±2.1) nm，屬于長尾噬菌體科。通過宿主譜測定，發(fā)現(xiàn)噬菌體Chy5宿主譜廣，不僅能感染結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株和結(jié)核臨床敏感株，還能感染絕大多數(shù)結(jié)核臨床耐藥株，有望應(yīng)用于熒光報告噬菌體構(gòu)建，故進(jìn)一步完成基因測序工作，了解其遺傳信息。

Chy5基因組全長51 214 bp，G+C含量63.60%，同大多數(shù)A簇噬菌體相同，但低于其宿主菌恥垢分枝桿菌(67.4%) 和結(jié)核分枝桿菌(65.6%)[12]。據(jù)共線性分析結(jié)果，與Chy5基因組最相似的噬菌體是D29，各基因高度同源，提示其為A簇噬菌體。

經(jīng)過基因功能預(yù)測分析，證實(shí)Chy5基因組中含有編碼整合酶和阻遏蛋白的基因及attP位點(diǎn)。然而，盡管具有整合酶及attP位點(diǎn)，D29仍然是裂解性噬菌體，這是由于其阻遏蛋白基因上一個3.5 kb長的片段的缺失所致[13]。Donnelly-W等證實(shí)，當(dāng)溶源性噬菌體L5的阻遏蛋白部分或全部缺失后，其亦無法形成溶源菌[9]。因此，具有活性的阻遏蛋白是維持噬菌體溶源性的必備條件。Chy5 ORF 70與噬菌體Pukovnik的阻遏蛋白相似度僅70.82%，尚無法確定其阻遏蛋白活性。但進(jìn)一步行紫外線誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線照射，可從分離所得的Chy5溶源菌中誘導(dǎo)出噬菌體，證實(shí)Chy5確為溶源性噬菌體。另外，溶源性噬菌體無法裂解自身溶源菌的現(xiàn)象，稱為超免反應(yīng)；這是由于噬菌體與溶源菌中相同的基因組相互免疫導(dǎo)致的[7,14]。而相似的基因組之間也會不同程度的發(fā)生這種現(xiàn)象[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體Chy5幾乎無法在Chy5溶源菌菌苔上形成噬菌斑，低滴度的噬菌體D29亦無法在Chy5溶源菌菌苔上形成清晰的噬菌斑，提示發(fā)生超免反應(yīng)。

上述實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Chy5為溶源性噬菌體，然而Chy5 ORF 70與Pukovnik的阻遏蛋白存在差異,提示兩者共存某些重要元件使Chy5阻遏蛋白的活性得以保持。有研究表明，L5阻遏蛋白能保持溶源性穩(wěn)定與其含有helix-turn-helix (HTH)DNA 結(jié)構(gòu)域相關(guān)[9,15]。利用NCBI的CD-search功能，搜索噬菌體Chy5和Pukovnik的阻遏蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)均存在HTH DNA 結(jié)構(gòu)域，這可能是Chy5 阻遏蛋白能保持活性的原因。

因此，噬菌體Chy5是一株可感染結(jié)核菌的溶源性噬菌體，遺傳背景清楚，有望應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌鑒定及耐藥菌檢測。

利益沖突：無