姜黃素在小鼠肺成纖維細胞中的抗纖維化作用?

龔 玲，劉代順，朱紅蘭

(遵義醫科大學第三附屬醫院(遵義市第一人民醫院呼吸內科)，貴州 遵義 563002)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種慢性、進行性、纖維化性間質性肺疾病[1]，臨床主要表現為進行性呼吸困難，并伴隨肺功能下降，該病病因不清，病變局限在肺臟，其特征表現為普通型間質性肺炎，該病每年以11%的比例增長[2-3]。IPF診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數腫瘤，因此被稱為一種“類腫瘤疾病”[4]。姜黃素(curcumin, Cur)是二酮類化合物，近年的研究表明，它有一些新的藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗纖維化以及防癌等作用，且無明顯的毒副作用[5-7]。Smith MR等[8]報道，姜黃素可通過抑制TGF-β/Smad信號通路表達，從而抑制肺纖維化的形成。Lin J等[9]報道，在肝星狀細胞中，姜黃素通過刺激PPAR-γ(peroxisome proliferater activated receptor, PPAR-γ)生成增加，從而抑制PDGF-β(platelet derived growth factor, PDGF-β)下游PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導來抑制肝纖維化的發生。但是姜黃素在肺纖維化的發生發展中是否具有同樣的作用，還有待進一步的考究。因此，本實驗旨在通過PPAR-γ配體羅格列酮、PDGF-β探討姜黃素在小鼠肺成纖維細胞中的抗纖維化分子機制，為進一步研究及臨床治療肺纖維化提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞

C57BL/6小鼠肺成纖維細胞(CRL-6013TM)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)公司，實驗中所用細胞均為第2～3代。

1.2 藥物

姜黃素(C1386)購于美國Sigma Aldrich公司，10 mg/瓶，姜黃素純度>99.5%，分子式：[HOC6H3(OCH3)CH=CHCO]2CH2，分子量：368.38。羅格列酮(Rosi)(R2408)購于美國Sigma Aldrich公司，10 mg/支，羅格列酮純度>98%，分子式：C18H19N3O3S，分子量：357.43。

1.3 試劑

PPAR-γ兔抗小鼠(美國 Cellsignal)；PDGFR-β兔抗小鼠(美國 Cellsignal)；TGF-β2(美國 R&D Systems)；辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(美國 Cellsignal)；Trizol試劑(美國Invitrogen)；PCR試劑盒(日本TaKaRa)；PCR引物合成(中國 生工)；DMEM(美國 Hyclone)；瓊脂糖(美國Cambrex公司)；ELISA試劑盒(美國 R&D Systems公司)；MTT試劑盒(中國凱基公司)；DNA marker(日本TaKaRa公司)。

1.4 細胞培養

將細胞懸液移入塑料離心管中，加入DMEM培養基10 mL，混勻后低速離心5 min，小心棄上清液。重新加入DMEM(含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素)培養基重新混勻細胞，應用血球計數板進行計數，活細胞率95%，以每瓶1×106個/ml接種到10 cm2培養皿中，放置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中進行培養。每隔2～3 d換液，細胞長至70%～80%融合狀態時用于實驗。

1.5 細胞藥物處理

參照文獻[10]，TGF-β2刺激濃度為10ng/ml。參照文獻[11]，姜黃素使用二甲基亞楓溶解，刺激濃度為5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L。參照文獻，Rosi[12]用二甲基亞楓溶解，刺激濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。

1.6 MTT實驗

取對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，細胞培養24 h后設置調零孔，未處理組UNT，細胞分為TGF-β2組(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黃素組(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)，每組設置3個復孔，分別培養0、24、48、72 h，檢測生長抑制作用時吸去孔內上清液。酶聯免疫監測儀檢測各孔在490 nm處吸光光度并記錄其結果。

1.7 細胞生長形態觀察

相同密度的細胞分別接種于10 cm2培養皿中，根據MTT實驗結果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/L，細胞培養24、48、72 h后用倒置顯微鏡進行觀察。

1.8 RNA提取及聚合酶鏈反應

細胞分為空白組、TGF-β2組(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黃素組(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)。細胞培養24 h后使用Trizol試劑提取總RNA，測定A260/A280吸光度判斷純度和濃度后，取2 μL總RNA使用cDNA反轉錄試劑盒進行反轉錄DNA。PCR反應過程：反應體系25 μL，94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個PCR循環，最后72 ℃總延伸10 min。檢測PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA光密度值。

表1 PCR引物序列

1.9 免疫印跡實驗

根據MTT實驗結果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/l、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/L，藥物干預48 h后采用Western blot法檢測。實驗步驟詳見參考文獻[14]。放射自顯影后凝膠成像儀內掃描，圖像分析軟件(Quantity One4.1) 進行分析，以PPAR-γ、PDGFR-β的吸光度比值進行相對定量。

1.10 酶聯免疫吸附試驗

根據MTT實驗結果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/l，培養24 h后收集培養基，離心提取上清后作為待測樣品，實驗步驟詳見參考文獻[13]。

1.11 統計學方法

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠肺成纖維細胞活力、增殖情況

圖1、2示，在TGF-β2刺激下，C57BL/6小鼠肺成纖維細胞活力、增殖均隨姜黃素及羅格列酮濃度梯度增加和時間梯度增加受到明顯抑制，TGF-β2+姜黃素組50 μmol/L在48、72 h時抑制C57BL/6小鼠肺成纖維細胞活力、增殖最明顯，TGF-β2+羅格列酮組40 μmol/L在48、72 h時抑制C57BL/6小鼠肺成纖維細胞活力、增殖最明顯(P<0.05)。

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細胞用TGF-β210 ng/ml及不同濃度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分別作用，培養(0、24、48、72 h)后進行MTT實驗。圖A為Cur實驗組，圖B為Rosi實驗組。 Cur實驗組與空白組比較：P=0.000；Rosi實驗組與空白組比較：P=0.000，差異有統計學意義。圖1 姜黃素、羅格列酮對C57BL/6小鼠肺成纖維細胞活力的影響

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細胞用TGF-β210ng/ml及TGF-β210 ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別作用，培養(0、24、48、72 h)后進行鏡下觀察圖2 姜黃素、羅格列酮對C57BL/6小鼠肺成纖維細胞增殖的影響(×200)

2.2 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達水平影響

圖3示，姜黃素和羅格列酮均使PPAR-γmRNA表達上調且存在明顯濃度依賴，姜黃素在50 μmol/L時PPAR-γmRNA表達上調最明顯，羅格列酮在40 μmol/L時PPAR-γmRNA表達上調最明顯。姜黃素和羅格列酮均使PDGF-βmRNA表達下調且存在明顯濃度依賴，姜黃素在50 μmol/L時PDGFR-βmRNA表達下調最明顯，羅格列酮在40 μmol/L時PDGF-βmRNA表達下調最明顯(P<0.05)。

2.3 PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表達

圖4示，在TGF-β2刺激下，PPAR-γ蛋白表達增加，但當加入姜黃素及羅格列酮后，PPAR-γ蛋白表達增加更明顯，說明姜黃素和羅格列酮均存在促進PPAR-γ蛋白生成增加的作用。在TGF-β2刺激下，PDGFR-β蛋白表達增加，但當加入姜黃素及羅格列酮后，PDGFR-β蛋白表達降低，說明姜黃素和羅格列酮均存在抑制PDGFR-β蛋白生成增加的作用(P<0.05)。

2.4 膠原蛋白-1生成影響

圖5示，TGF-β2誘導膠原-1生成增加，但當加入姜黃素和羅格列酮后膠原-1生成減少，說明姜黃素和羅格列酮均抑制TGF-β2誘導膠原-1的生成(P<0.05)。

3 討論

IPF主要表現為彌漫性肺間質纖維化伴隨輕度炎癥，成纖維細胞灶與正常肺組織并存，細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的大量增生和沉積，使蜂窩組織的形成。該病典型臨床表現為咳嗽、咳痰，動則氣短、干咳、喘憋，后期出現進行性呼吸困難，還具有慢性、反復發作等特點。根據病因病機和臨床表現，該病屬于中醫學“喘證” “肺脹” “氣短” “痰飲” “咳嗽” “肺痹” “肺痿”等范疇。目前，現代醫學對肺纖維化尚無有效的治療措施。從近些年中醫藥治療肺纖維化的研究文獻中可以看到，隨著中醫辨證辨病治療對該病病因病機研究的深入，中醫藥在治療和控制該病上顯現出越來越大的優勢，中醫可以減輕咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，增加動脈血氧分壓，縮短病程，改善生活質量等。但總體而言，本病研究尚處于起步階段，因此利用中醫學尋求有效的治療方法，對IPF診治具有深遠意義。

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細胞用TGF-β210 ng/ml及不同濃度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分別作用24 h后用PCR實驗進行PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA檢測。左圖為TGF-β2+ Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)檢測PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達，右圖為 TGF-β2+Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)檢測PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達。結果使用表示，姜黃素實驗組：*P=0.002，羅格列酮實驗組：*P=0.001，差異有統計學意義圖3 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA在不同濃度姜黃素、羅格列酮刺激下的表達

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別作用，培養24 h后用Western blotting實驗進行PPAR-γ、PDGFR-β蛋白檢測。左圖為檢測PPAR-γ蛋白表達，右圖為檢測PDGFR-β蛋白表達。結果使用表示，TGF-β2刺激組與Rosi組比較：*P=0.000，TGF-β2刺激組與Cur組比較：*P=0.000，TGF-β2刺激組與Rosi組比較：**P=0.000，TGF-β2刺激組與Cur組比較：**P=0.001，差異有統計學意義圖4 姜黃素、羅格列酮對PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表達的影響

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別培養24 h，用ELISA實驗進行膠原-1檢測。結果使用表示， Cur及Rosi 實驗組分別與空白組比較：*P=0.019，*P=0.01，Cur及Rosi 實驗組分別與TGF-β2刺激組比較：**P=0.005，**P=0.02，差異有統計學意義圖5 姜黃素及羅格列酮對膠原蛋白-1的影響

姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取的一種化學成分，其中姜黃約含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，為二酮類化合物[11]。隨著對姜黃素研究的日益深入，已發現其具有抗炎、抗氧化、調脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性。本實驗研究發現，在TGF-β誘導C57BL/6小鼠肺成纖維細胞轉化過程中發現，姜黃素不僅可以刺激PPAR-γ表達增加，還可以使PDGF-β表達下調。PPAR-γ表達增加不僅會抑制細胞增殖及活力，還可以使膠原-1表達減少，從而導致肺纖維化形成受阻。此外，PPAR-γ促使PDGF-β表達下調后可進一步導致細胞周期阻滯及凋亡增加，細胞增殖及活力受到抑制，同樣可以阻礙肺纖維化形成。Lin J[10]等學者通過肝星狀細胞證實，姜黃素可以通過刺激PPAR-γ表達增加，從而阻止PDGF-β下游信號通路的傳導來抑制肝纖維化發生。因此，通過本實驗推測，在TGF-β誘導肺成纖維細胞轉化過程中，姜黃素刺激PPAR-γ表達增加后促使PDGF-β表達下調，從而導致PDGF-β下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導受抑制，肺成纖維細胞增殖和活力受抑制，膠原-1合成表達減少，肺纖維化形成受影響。但是為驗證這一機制是否合理，還需要利用姜黃素通過動物實驗進一步驗證。

PDGF-β作為PDGF的受體亞單位，僅與PDGF B鏈有高親和力。在肝纖維化時，肝星狀細胞表面的PDGF-β與PDGF-BB結合后促進肝纖維化發生，抑制PDGF-β及其下游信號通路的傳導，是抑制肝纖維化的關鍵點。由于PDGF-β在肝纖維化形成過程中的作用已經比較明確，結合本實驗結果推測，在C57BL/6小鼠肺成纖維細胞轉化過程中，TGF-β2促使PDGF-β表達上調，從而導致細胞增殖及活力增加，膠原沉積表達增加，然而姜黃素卻通過刺激PPAR-γ表達增加來阻止PDGF-β及其下游信號通路傳導，導致細胞周期阻滯及凋亡增加，細胞增殖及活力受到抑制，肺成纖維細胞轉化受到影響，纖維化形成減少。此外結合本實驗結果還推測，PDGF-β表達下調可能是通過抑制其下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導來阻止纖維化的發生，這與Kulkarni AA[14]等學者所證實的PPAR-γ配體通過抑制FAK下游的PI3K/AKT信號通路傳導來阻止肺纖維化發生不謀而合。但為證實該機制是否正確，還需利用PDGF下游信號通路藥物深入探討。

羅格列酮是目前研究最多的PPAR-γ經典合成配體，是PPAR-γ的高選擇性、強效激動劑，與PPAR-γ親和力最大。越來越多的證據顯示，羅格列酮不僅在炎癥反應免疫調節中發揮著重要作用，還參與某些器官纖維化進程，如皮膚、肝臟、肺等。通過研究還發現，在TGF-β誘導小鼠肺成纖維細胞C57BL/6分化過程中，羅格列酮通過與PPAR-γ受體結合后刺激PPAR-γ表達增加，除了抑制細胞增殖及活力以外，還抑制膠原-1的表達。

圖6 PPAR-γ/PDGF-β信號通路圖

因此結合本實驗結果推斷，姜黃素與羅格列酮均可通過刺激PPAR-γ表達增加，從而抑制PDGF-β表達來阻止纖維化的發生。羅格列酮作為PPAR-γ配體通過與PPAR-γ受體結合來阻止肺纖維化發生。姜黃素除本身具有抗纖維化和抗氧化作用以外，還可通過刺激PPAR-γ表達增加來阻止肺纖維化發生。

綜上所述，姜黃素和羅格列酮均有抗肺纖維化的作用，刺激PPAR-γ表達增加，從而抑制PDGF-β下游信號通路的傳導，可能是阻止肺纖維化的發生發展的關鍵。姜黃素對肺纖維化治療可能存在潛在的臨床應用價值。