應用小動物活體激光共聚焦成像系統(tǒng)對大鼠腹壁循經(jīng)組織組織液分布的初步觀察?

宋曉晶，張維波△，賈術永，王廣軍，李宏彥，葉豐瑤,2，顧 鑫,2，熊 楓

(1. 中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

今年初，ScientificReport發(fā)表了美國一研究團隊使用激光共聚焦內(nèi)窺鏡對人體多種組織間質(zhì)進行觀察的研究結(jié)果。報道發(fā)現(xiàn)，在活體的間質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中存在大量組織液，約為人體體液總量的1/5，這類網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)以及其中填充的組織液在常規(guī)形態(tài)學處理后消失。在此之前，這一間質(zhì)形態(tài)未被報道[3]。該文章在國內(nèi)外引起了熱議，國外媒體的報道認為此研究發(fā)現(xiàn)了人體的一個新器官，而國內(nèi)一些學者認為這類結(jié)構(gòu)應該是中醫(yī)的經(jīng)絡。然而，美國團隊的研究主要集中在各臟器黏膜、皮膚組織，并未關注中醫(yī)經(jīng)絡循行部位的組織，但為中醫(yī)經(jīng)絡研究提供了啟示。經(jīng)絡學說是重要的中醫(yī)基礎理論之一，經(jīng)絡行血氣是中醫(yī)理論闡釋人體生命活動、疾病發(fā)生變化以及針灸等療法原理的核心，揭示經(jīng)絡的現(xiàn)代科學內(nèi)涵對中醫(yī)的發(fā)展至關重要。圍繞經(jīng)絡的本質(zhì)，國內(nèi)外學者進行了大量探索，觀察到一些經(jīng)脈現(xiàn)象，取得了一定成果，初步證實經(jīng)脈的存在[1-2]。自上世紀60年代以來，國內(nèi)外一部分學者研究認為，組織間隙、組織液與經(jīng)絡的結(jié)構(gòu)和功能密切相關，其應該是經(jīng)絡實質(zhì)的一部分。但由于研究技術的限制，目前仍缺乏更多的客觀實驗證據(jù)證實二者在組織結(jié)構(gòu)上的相關性[4-6]。為進一步探討經(jīng)絡結(jié)構(gòu)與組織間隙、組織液的關系，研究活體沿經(jīng)絡循行路線的組織間質(zhì)結(jié)構(gòu)及組織液分布特征，本研究團隊使用先進的活體激光共聚焦成像系統(tǒng)對大鼠腹壁循經(jīng)組織進行了初步觀察，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠10只，平均年齡5～7周，體質(zhì)量380～420 g，由中國軍事醫(yī)學科學院動物中心提供(許可證號SCXK-(軍)2011-004)。本研究的實驗方案已通過中國中醫(yī)科學院針灸研究所動物倫理委員會審查批準，所有大鼠均按實驗動物飼養(yǎng)和使用的國際標準對待。

1.1.2 實驗儀器 小動物活體激光共聚焦成像系統(tǒng)(ViewnVivoB30，OptiScan公司，澳大利亞)；57-6F30 經(jīng)絡定位儀(東華儀器廠，中國)；恒冷箱切片機(Thermo Fisher Scientific公司，英國)；研究級正置顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光染料尾靜脈注射 用 2% 的戊巴比妥鈉(30 mg/kg) 大鼠腹腔注射進行麻醉，待大鼠充分麻醉后，將其按仰臥位固定在實驗臺上。將熒光素納染料(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)用注射用生理鹽水配制成10%的溶液，按0.1 ml/kg的劑量進行大鼠尾靜脈注射。

1.2.2 循經(jīng)低電阻點檢測 熒光染料注射后，立即沿大鼠腹部劍突橫切并剝離腹部皮膚，暴露3×5 cm范圍的腹壁，用消毒脫脂棉擦凈腹壁組織表面滲出物。使用 57-6F30 經(jīng)絡定位儀(東華儀器廠，中國)檢測大鼠腹壁正中線(相當于任脈循行線)，與任脈線平行旁開5 mm、1cm的非經(jīng)循行線上的電阻抗，用油性標記筆標記出任脈線上的3個低電阻點(A、B、C點)，與任脈線A點平行旁開5 mm的非經(jīng)線上的高電阻點D點，與任脈線A點平行旁開1 cm的非經(jīng)線上的高電阻點E點。

1.2.3 活體激光共聚焦成像檢測方法和圖像分析 將活體激光共聚焦成像系統(tǒng)的掃描深度分別設置為8、20 μm，激光功率設為130μW。在熒光染料注射30 min時，將掃描探頭垂直放置在大鼠腹壁表面，觀察、采集大鼠腹壁表面任脈循行線上A、B、C共3點，與任脈A點平行旁開5 mm、1 cm的非經(jīng)循行線D、E點，以及腹壁其他區(qū)域組織的激光共聚焦成像圖。用激光共聚焦成像系統(tǒng)軟件分析成像視野中熒光染料的分布特征和組織微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.4 活體組織切片觀察 用阿爾新藍(alcian blue，AB)標記腹中線(任脈)上已經(jīng)觀察過的A、B、C點，迅速切取以標記點為中心大小約1×1×0.5 cm的腹壁組織，放置在恒冷箱切片機速凍臺速凍，做20 μm的冰凍切片，避光自然風干后封片，在熒光顯微鏡下觀察大鼠任脈循行線上的組織與旁開組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹壁任脈循行線組織的活體激光共聚焦成像特征

圖1示，活體小動物激光共聚焦成像系統(tǒng)外觀，從主機接出的激光發(fā)射器通過光纜連接到激光探頭上，探頭可插入體腔內(nèi)進行觀察，也可直接在組織表面進行觀察。本研究使用探頭體表接觸的采集方式。在獲取的圖像中，亮色區(qū)反應熒光染料溶液分布或浸染包繞的區(qū)域，白色越多越亮代表含有熒光染料的組織液越多，暗色區(qū)反映為各種實體組織、細胞結(jié)構(gòu)。

圖1 ViewnVivoB30活體小動物激光共聚焦成像系統(tǒng)

圖2示，熒光染料注射約30 min后，檢測深度為8 μm或20 μm時，大鼠腹壁表面正中線(任脈循行線)上的A點組織中大部分為白亮區(qū)域，這些區(qū)域是進入組織間隙的熒光染料和組織液混合的成像顯示。在大片的白亮區(qū)域中分布有排列成層狀或散亂分布且粗細不等的暗色線狀結(jié)構(gòu)，其為膠原纖維和彈性纖維；顯示的暗色不規(guī)則類圓形結(jié)構(gòu)為脂肪細胞，其間隙中分布著分支的線管狀結(jié)構(gòu)，其中包含大量暗色不規(guī)則圓球，在連續(xù)觀察時沿管腔內(nèi)移動，這些不規(guī)則圓球是紅細胞，管線狀結(jié)構(gòu)為毛細血管；視野中還出現(xiàn)了一條邊界清晰、粗大的暗色線條狀組織，為粗的膠原纖維(圖2 A、B)。由于動物呼吸在同一檢測位點成像組織范圍會略有移動，因此在A、B圖中的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)位移。此外，腹壁正中線上3個不同觀察點的激光共聚焦成像圖均顯示組織中的白亮區(qū)域較多，即均含有大量混有熒光素鈉的組織液；在其中分布著絲狀結(jié)構(gòu)的實體組織、膠原和彈性纖維，少量的類脂肪細胞和毛細血管(圖2C，D)。不同深度、不同位點的組織圖像中白亮區(qū)域均較多，表明任脈循行線組織中組織間隙大，組織液含量豐富。

注：A為A點檢測深度8 μm，B為A點檢測深度20 μm，C為B點，D為C點。淺箭頭所示為毛細血管，深箭頭所示可能為纖維結(jié)締組織，稍淺箭頭所示可能為毛細淋巴管。E為A、B、C觀察位點示意，稍淺線上位點為腹中線水平旁開5 mm，淺線上位點為腹中線水平旁開1 cm圖2 大鼠腹壁正中線(任脈)組織的活體激光共聚焦圖(×1000)

2.2 大鼠腹壁非經(jīng)脈循行線組織活體激光共聚焦成像特征

圖3示，檢測深度為20 μm時，A圖任脈循行線組織中白亮區(qū)域較多，與任脈循行線B點平行旁開5 mm的腹壁組織D點處，成像視野中的白亮色區(qū)域減少，出現(xiàn)了大量排列緊密的直徑約為20～40 μm的實體組織，為脂肪細胞；在旁開1 cm的E點處，白亮色區(qū)域面積顯著減少，而且亮度減弱；視野中出現(xiàn)了大片的黑色區(qū)域為肌肉組織；在肌肉組織之間存在較細的線狀白亮條帶，這些長程的白亮線與片狀的白亮區(qū)連通。這一結(jié)果提示，腹壁非經(jīng)組織主要為實體組織，組織中的間隙空間和組織液含量遠遠小于腹中線沿任脈循行的部位。

注：A為B點，B為腹壁正中線水平旁開5 mm的D點，C為腹壁正中線水平旁開1 cm的E點圖3 大鼠腹壁正中線(任脈)及其旁開組織的活體激光共聚焦圖(×1000)

注： 與正中線垂直的腹壁組織橫斷面切片(100×)，B(40×)和C(200×)為與腹壁組織平行的切片，※所示為組織間隙，白箭頭所示為阿爾新藍(AB)標記的腹壁任脈線觀察點，黑箭頭所示為疏松結(jié)締組織層，淺箭頭所示為肌肉組織圖4 大鼠腹壁正中線(任脈)及周圍組織新鮮冷凍切片形態(tài)圖

2.3 大鼠腹壁腹中線組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

圖4示，熒光顯微鏡下觀察到，大鼠腹壁新鮮組織冰凍切片中綠色熒光浸染的為實體組織，暗色區(qū)域為組織間隙。在與腹壁表面垂直的組織切片中可以觀察到，被AB標記的腹中線任脈上的觀察點A(左側(cè)腹壁表面黑色條帶處)處下方是熒光染料浸染的疏松結(jié)締組織層；其下方是較寬大的暗色空間，為組織間隙；間隙兩側(cè)是熒光染料浸染的肌肉組織，這些肌肉組織在AB標記點之外，即為任脈循行線兩側(cè)的非經(jīng)線區(qū)域(圖4A)。組織切片顯示，大鼠腹中線組織具有比旁開組織較大的組織間隙，這一形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與激光共聚焦成像結(jié)果吻合。在與腹壁表面平行的組織切片中(包含腹中線的腹壁組織)，綠色區(qū)域為熒光染料浸染的肌束，暗色區(qū)域為組織間隙；在腹壁的肌纖維之中，分布著大小不等的間隙，縱橫交錯且相互連接溝通(圖4B、C)。這一特征也與活體激光共聚焦成像結(jié)果一致。

3 討論

人體組織中含有60%～70%的水，其中約2/3在細胞內(nèi)為細胞內(nèi)液，1/3為細胞外液。在細胞外液中，1/4為血液，3/4為組織液。早期的生理學教科書認為，組織液是不流動的凝膠態(tài)物質(zhì)，直到1993年挪威的Aukland教授提出了組織液的兩相說即凝膠相和液相，認為存在流動的組織液[7]，但是液相組織液的存在一直未得到證明。2007年，在一篇綜述中報道瑞士的Swartz使用激光共聚焦顯微鏡，在離體組織中觀察到一個10 μm的液態(tài)組織液顆粒，但并未介紹該研究詳細的實驗資料及其他實驗室的驗證工作[8]。直至2018年，美國Benias等使用激光共聚焦內(nèi)窺鏡在活體上觀察到人體間質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在液相組織液[3]。這是對組織液兩相說的首次實驗證明，將開啟認識生命的新篇章。

組織液與經(jīng)絡實質(zhì)密切相關的學術觀點可追溯到上世紀60年代日本藤田六郎提出的經(jīng)絡脈管外體液路徑說[4]，但該假說并未進行實驗驗證。20世紀80年代，孟競璧等使用同位素示蹤技術觀察到在人體四肢穴位注射同位素后，可出現(xiàn)沿古典經(jīng)脈循行路線遷移的示蹤軌跡[9]。當時，對于同位素示蹤軌跡的結(jié)構(gòu)有各種猜測，孟競璧認為是一種脈管外的小分子通道，但并未對循經(jīng)示蹤軌跡的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行深入研究。90年代以來，張維波提出經(jīng)脈具有低流阻特性的假設，并運用組織液流動的達西定律和連續(xù)性方程，推論出組織液向經(jīng)脈匯聚和沿經(jīng)脈流動的流場模型[10]；隨后使用改進的Guyton流阻方法證明了經(jīng)脈的低流阻(高流導)特性[11]。同時，結(jié)合組織液壓波傳播的測量、同位素及AB示蹤觀察，最終發(fā)現(xiàn)循經(jīng)低流阻通道[12]。他提出經(jīng)脈(絡)是結(jié)締組織中流阻(液體流動的阻力)較低的連續(xù)多孔介質(zhì)(孔隙度高、滲透性高)，組織液填充在其中。在生命活動過程中，一定范圍內(nèi)的組織液流動引起間質(zhì)環(huán)境內(nèi)物質(zhì)、信息、能量的傳遞和交換，繼而產(chǎn)生各種生物學效應。這一學說很好地與經(jīng)絡行血氣的理論契合[13]。但由于當時尚缺乏能夠直接觀察活體的間質(zhì)結(jié)構(gòu)及其中組織液的技術，因此經(jīng)脈低流阻組織液通道的觀點未能得到最直接的實驗證明。

對于經(jīng)絡實質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究，自1963年朝鮮金鳳漢以來，幾乎所有對經(jīng)絡組織結(jié)構(gòu)的研究都沿用常規(guī)的解剖或形態(tài)學技術進行組織結(jié)構(gòu)觀察。有研究者對組織中循經(jīng)遷移的同位素進行放射性自顯影觀察，可辨識出同位素位于血管外的組織間隙中[14]，但放射性顯影的分辨率很低，無法對間隙的具體形態(tài)結(jié)構(gòu)進行顯示，因此無法揭示同位素循經(jīng)遷移軌跡的結(jié)構(gòu)。蔡國平等曾對間質(zhì)中的纖維成分進行形態(tài)學觀察，組織固定脫水后無法真實還原間質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[15]。考慮到組織液本身及其對保持組織空間形態(tài)的重要性，張維波等用身體接近透明的彩裙魚為研究對象，將AB染液注射到彩裙魚的體內(nèi)，當染料出現(xiàn)縱向遷移后立即進行整體冷凍，較完整地保留了組織間隙的結(jié)構(gòu)和其中液體，在透射光下觀察1 mm厚的新鮮冰凍切片，結(jié)果顯示AB液 是在透明魚的組織間隙之中遷移[16]，但該通道的細微結(jié)構(gòu)特別是細胞外液體的分布仍難以觀察。

活體激光共聚焦成像技術是在傳統(tǒng)的電子內(nèi)鏡基礎上整合了共聚焦激光顯微鏡而成，可對活體組織進行一定深度的斷層掃描成像，并能排除聚焦平面之外組織的干擾，具有放大 1000 倍的能力，以亞微米的高分辨率實時精準捕捉活體組織成像，顯示組織、細胞的顯微結(jié)構(gòu)，目前此技術已經(jīng)在活體組織微區(qū)高分辨成像[17]、組織分子和微血管事件追蹤[18]、癌細胞轉(zhuǎn)移追蹤等方面開展了應用[19]。經(jīng)絡低流阻組織液通道學說提出已有幾十年，但直到活體激光共聚焦成像技術出現(xiàn)才有可能得到直接的證明，其將是研究經(jīng)絡的關鍵技術。本實驗采用專用于動物實驗的激光共聚焦成像系統(tǒng)在體觀察大鼠腹壁循經(jīng)組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。由于此儀器探頭的激光穿透深度有限，因此本實驗是在剝離皮膚的大鼠腹壁表面進行的。

本實驗采用的熒光素鈉是一種易溶于水且無特異性親和性的“水指示劑”，靜脈注射后主要是存在于血管中，會隨著血漿從毛細血管滲透入到組織中，成為組織液，并按照組織液流場規(guī)律向間隙較多且流阻較低的大間隙匯聚。在熒光成像系統(tǒng)的激光激發(fā)下，可用于顯示組織中水的分布，同時可顯示被熒光染料溶液包圍浸染的組織、細胞的形態(tài)[20]。因此在活體組織中，以熒光素鈉溶液所發(fā)熒光為背景，經(jīng)過特殊光學成像處理，可無創(chuàng)地觀察原位組織微區(qū)的形態(tài)學特征，特別是與組織液相關的結(jié)構(gòu)，為活體研究生命活動和組織結(jié)構(gòu)提供了極大的便利。

在本研究中，大鼠尾靜脈注射熒光素鈉溶液30 min后，在大鼠活體和新鮮腹壁任脈循行組織冰凍切片均觀察到，腹壁組織中分布著大小不等、縱橫交錯充盈著組織液的組織間隙，這些大小不等的間隙縱橫交錯分布在組織中相互溝通連接。其中在腹中線任脈位置上的組織間隙較大，組織液的含量最多，符合任脈為諸陰經(jīng)之匯的特征。而正中線兩側(cè)的組織主要為實體組織結(jié)構(gòu)，組織間隙較小。此外，在任脈組織中發(fā)現(xiàn)分布著類似管道的結(jié)構(gòu)，管道周圍分布著組織液，且越靠近管道壁的熒光染料亮度越高，表明管道周隙的組織液量越豐富；在肌間隙中也觀察到細長的組織間隙通道，充滿了含有熒光素鈉的組織液與周圍組織連通。這一分布特征證明了張維波1997年對經(jīng)絡的低流阻假設和組織液的流場模型[11]。有研究者在肢體穴位注射熒光染料，用體視熒光顯微鏡觀察到長程的被熒光染料浸染的血管周隙結(jié)構(gòu)，認為這一通道結(jié)構(gòu)與中醫(yī)經(jīng)絡有關[21]。但此研究在穴位注射前將穴位遠端血管與周圍組織分離，在注射后局部組織間質(zhì)的液壓增加，這些因素均會引起組織間質(zhì)空間的形變。實驗顯示，通道結(jié)構(gòu)難以真實反映機體的間隙結(jié)構(gòu)和組織液分布特征。此外，美國團隊的研究尚未觀察到間質(zhì)中有通道樣的結(jié)構(gòu)存在，其專門介紹的膽外總管間質(zhì)為多角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，組織液填充其中[3]，這種黑白相間的間質(zhì)形態(tài)可能是管腔黏膜的特征間質(zhì)組織液結(jié)構(gòu)，與本研究在大鼠腹壁觀察到的相互連通的組織間隙，以及條帶樣通道結(jié)構(gòu)在性質(zhì)和功能上可能存在一定的差異。

組織液在通道中流動時，在進入淋巴管內(nèi)的同時還接受來自上游及周圍組織的組織液，形成動態(tài)平衡。有序的組織液通道就像城市的排水溝，為淋巴液的高效率生成提供了條件。因此有研究者提出，組織液通道可稱為組織通道(tissue channel)或前淋巴管(pre-lymphatics)[22]。組織液通道的上游源泉是毛細血管濾出液，其成分與去除血細胞后的血漿成分相同。組織液的正常流動可使細胞代謝物得到及時清除，并保證細胞周圍的微環(huán)境與血漿接近，后者是全身生理調(diào)節(jié)的目標并時刻處于穩(wěn)態(tài)中。但由于絕大多數(shù)細胞并不浸泡在血液里，而是在組織液的環(huán)境中，故將標準成分的血漿及時輸送到細胞周圍，使細胞周圍的微環(huán)境保持穩(wěn)態(tài)，對細胞的正常功能活動具有重要意義。因此可以認為，遍布于機體組織間隙中的組織液，其生物學特性與經(jīng)絡“行血氣而營陰陽，濡筋骨，利關節(jié)”“決生死，處百病”的功能十分相似。此外，組織液和組織液通道是否具有溝通全身表里上下，平衡人體臟腑陰陽的功能以及傳遞病邪和針刺治療信息等，有待進一步的實驗研究探討，以最終確定它與中醫(yī)經(jīng)絡的關系。

本研究首次采用新型的激光共聚焦成像技術在大鼠體壁組織觀察到縱橫相交的組織間隙和組織液分布，以及長程的間隙通道存在，活體顯示了循經(jīng)組織與非經(jīng)組織的組織液分布和形態(tài)特征差異，為中醫(yī)經(jīng)絡實質(zhì)研究提供了新的實驗資料，這一技術的應用將為中醫(yī)經(jīng)絡研究開辟新方向。對于初步觀察到的這些特征結(jié)構(gòu)尚需要更多的形態(tài)學證據(jù)進一步驗證，而全身其他經(jīng)脈循行區(qū)域的間質(zhì)結(jié)構(gòu)和組織液分布特征也有待進一步的觀察研究。