敲減CDKL5對人膠質(zhì)母細胞瘤細胞表觀遺傳學(xué)的影響①

張驚宇 鄭永慧 初婷婷

(黑龍江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,哈爾濱 150081)

近期有研究發(fā)現(xiàn)CDKL5敲除鼠的運動協(xié)調(diào)性差、少動、視力差，驚厥處理時腦電圖異常，視覺誘發(fā)反應(yīng)下調(diào)，這與雷特綜合征和自閉癥的表型相似[1]。敲除鼠的神經(jīng)干細胞增殖更快，新生顆粒神經(jīng)元凋亡水平更高，導(dǎo)致分化的成熟神經(jīng)元減少，樹突嚴重萎縮，皮層更薄[2]。敲除CDKL5雖然抑制神經(jīng)元的分化，卻不影響膠質(zhì)細胞的分化[3]。敲除鼠腦中Akt、AMPK、PKC和MAKP信號通路受到影響，其中主要抑制Akt及下游mTOR、RSK和GSK-3β的磷酸化。抑制GSK-3β的活性可改善CDKL5敲除的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的缺陷[4]。此外，在成纖維細胞中，CDKL5通過調(diào)控剪切調(diào)控蛋白的磷酸化狀態(tài)來控制核小斑的形態(tài)，核小斑能持續(xù)為活性轉(zhuǎn)錄位點提供剪切因子，且確定CDKL5影響選擇性剪切[5]。CDKL5還調(diào)控基因表達。在CDKL5突變的誘導(dǎo)型多能干細胞中，GluD1(glutamate D1 receptor)的表達下調(diào)。GluD1能誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元的抑制性突觸前分化，與神經(jīng)疾病有關(guān)。 CDKL5的表達受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控。神經(jīng)系統(tǒng)中(腦紋狀體和前扣帶皮層、PC12細胞)MeCP2和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶都抑制CDKL5的表達[6,7]，而MeCP2和Dnmt1正是CDKL5的激酶底物[8]。

1 材料與方法

1.1材料 細胞培養(yǎng)板購自美國corning公司；所有培養(yǎng)基及添加劑均購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；載體pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA購自紐恩生物科技公司；CDKL5(ab22453)購自Abcam公司；GAPDH購自Sigma-Aldrich公司；Dnmt1購自Cayman公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87添加1%非必需氨基酸和1%(1 mmol/L)丙酮酸鈉；所有細胞均置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度5%。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建CDKL5 shRNA所用的載體為pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。實驗涉及的shRNA序列為shCDKL5 R：5′-CCGGAGTGAGAGCTAAAG-GCATTTTCAAG-3′,F:5′-AGAAATGCCTTTAGCTCTCACTTTTTTTG-3′。……