三種皮膚修復材料對糖尿病大鼠皮膚損傷修復的有效性評價

韓倩倩 曲明悅 薛彬 王春仁

皮膚修復材料作為近年來新的皮膚損傷修復方式，顯示出良好的前景。糖尿病足等難愈性創(chuàng)面的皮膚修復對材料的性能和有效性有更高的要求，本研究采用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并在其背部形成全層皮膚缺損創(chuàng)面，以構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚損傷模型，用于評價膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿和明膠生物活性玻璃復合材料對難愈性皮膚損傷的修復作用，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及溶液配制

檸檬酸鈉緩沖溶液配制：2.10 g檸檬酸加100 mL雙蒸水配成檸檬酸母液； 2.94 g檸檬酸三鈉加100 mL雙蒸水配成檸檬酸鈉母液；將檸檬酸母液和檸檬酸鈉母液按1∶1.32的比例混合，調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5，得到所需的0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖溶液。

STZ溶液配制：將STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，配成濃度為10 mg/mL的STZ溶液，用濾菌器過濾除菌后避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

膠原蛋白膜、羧甲基殼聚糖止血海綿(杭州英健生物科技有限公司)，明膠生物活性玻璃復合敷料(上海硅健生物材料有限公司)。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量約200 g(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病大鼠皮膚損傷模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分成5組，每組8只。禁食一晚，空腹血糖<6.1 mmol/L的大鼠用于建立糖尿病大鼠模型。按照25 mg/Kg、50 mg/Kg、75 mg/Kg和100 mg/Kg的劑量腹腔注射STZ溶液，空白對照組注射檸檬酸鈉緩沖溶液。每天密切觀察所有試驗大鼠的一般情況。注射后第7、14、21和28天尾尖采血檢測非空腹血糖值。

將15只SD糖尿病大鼠隨機分成3組，麻醉，備皮，于雙耳連線中間向下大約8 cm處，以脊柱為中線分別切除1 cm×1 cm、2 cm×2 cm、3 cm×3 cm的正方形全層皮膚，深至肌層，用無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，醫(yī)用膠帶固定。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，第0、5、12、21天觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.3.2 三種材料對創(chuàng)面的有效性評價

將三種材料(膠原、羧甲基殼聚糖、明膠生物活性玻璃)剪至2 cm×2 cm大小。將80只SD糖尿病大鼠皮膚損傷模型隨機分為4組：空白對照組(n=20)、膠原組(n=20)、羧甲基殼聚糖組(n=20)、生物玻璃組(n=20)。膠原組、羧甲基殼聚糖組、生物玻璃組將相應(yīng)樣品直接敷在皮膚缺損創(chuàng)面，并用無菌敷料貼覆蓋；空白對照組直接用無菌敷料貼覆蓋創(chuàng)面。術(shù)后所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，每2天觀察實驗鼠的精神、活動和飲食變化，第3、7、14、21天打開敷料觀察創(chuàng)傷愈合與炎癥情況，拍照，作好觀察記錄，并在第14、21天取材進行病理切片檢查。

1.4 檢測指標

1.4.1 大體創(chuàng)面恢復情況

記錄造模后第3、7、14、21天大鼠創(chuàng)面滲出、黏連以及創(chuàng)口回縮等情況，大體判斷創(chuàng)面的恢復情況。

在34篇研究文獻中，我們可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的研究主要針對大學本科及以上的學生，而對于中小學的研究卻很少。即使是大部分實驗研究，實驗對象也更多是對于大學本科生，如畢鵬暉（2017）針對大二學生的問卷和訪談得出結(jié)果研究大學英語微移動詞匯學習融入形成性評估模式；李思縈、高原（2016）以4組非英語專業(yè)研究生為對象,通過測試考察了移動技術(shù)輔助外語教學與多模態(tài)結(jié)合對學習者詞匯習得的影響；孔繁霞、王歆（2014）基于“投入量假設(shè)”理論,探討了93名非英語專業(yè)二年級學生在閱讀、聽力、寫作任務(wù)中的詞匯附帶習得效果等。

1.4.2 創(chuàng)面愈合率

造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進行拍照(距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro)測算創(chuàng)面愈合率。

1.4.3 組織學檢查

造模后第14、21天，在創(chuàng)面上切取約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的皮膚組織，宜包含周圍正常皮膚組織， HE染色后觀察各時間點各組大鼠皮膚創(chuàng)面的修復情況和肉芽組織生長、炎癥反應(yīng)等。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型建立

注射STZ后，25 mg/Kg STZ組非空腹血糖值未到達糖尿病血糖標準(高于16.7 mmol/L)，動物精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤；50 mg/Kg STZ組部分大鼠非空腹血糖值>16.7 mmol/L，成模率為50%；75 mg/Kg STZ組所有大鼠血糖值均>16.7 mmol/L，動物精神狀態(tài)差，弓背捲體，動作緩慢，毛發(fā)無光澤，成模率100%；100 mg/Kg STZ組動物注射STZ后2 d內(nèi)死亡5只，4 d內(nèi)全部死亡。因此，確定以75 mg/Kg STZ單次腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型(圖1)。

圖1 各劑量組動物血糖變化情況Fig. 1 Changes of blood glucose in different concentration groups

2.2 皮膚損傷模型建立

圖2 術(shù)后第0、5、12、21天各組創(chuàng)面愈合情況Fig. 2 Skin wound healing at day 0, 5, 12, 21 after resection

2.3 三種修復材料的有效性評價

2.3.1 創(chuàng)面恢復情況

各組大鼠均未出現(xiàn)感染及死亡情況。術(shù)后第3天，空白對照組動物創(chuàng)面明顯紅腫、滲出，創(chuàng)面邊緣無收縮跡象；3種材料組的創(chuàng)面處均較干凈，無滲出，傷口邊緣皮膚開始向內(nèi)收縮。術(shù)后第7天，對照組仍有明顯滲出，傷口邊緣開始收縮；3種材料組傷口收縮明顯，創(chuàng)面均被肉芽組織填滿；術(shù)后第14天，對照組創(chuàng)面縮小，結(jié)痂；膠原組和生物玻璃組痂皮脫落，創(chuàng)面被新生的表皮覆蓋。術(shù)后第21天，空白對照組痂皮脫落，被新生表皮覆蓋；3個樣品組創(chuàng)面已基本愈合。

2.3.2 創(chuàng)面愈合率

造模后第3、7、14、21天對創(chuàng)面進行拍照(每只動物拍照距離和曝光方式相同)，用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro)測算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果顯示，術(shù)后第3、7、14和21天，膠原組和生物玻璃組的創(chuàng)面愈合率均高于空白對照組，且具有顯著性差異(P<0.01)；而羧甲基殼聚糖組的創(chuàng)面愈合率只在第3天略高于對照組，其余三個時間點均低于空白對照組，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 各組創(chuàng)面愈合率比較(**： P<0.01)Fig. 3 Wound healing rate of each group (**： P<0.01)

2.3.3 組織學檢查

術(shù)后第14天，膠原組和明膠生物玻璃組表皮已基本覆蓋全部創(chuàng)面，且出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，有小血管增生，皮膚附屬器清晰可見；羧甲基殼聚糖組仍有部分創(chuàng)面未被表皮覆蓋，未形成層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，真皮層內(nèi)可見毛細血管的閉合、退化和消失，未見皮膚附屬器；空白對照組部分創(chuàng)面無表皮覆蓋，仍可見較多的新生血管和成纖維細胞，無皮膚附屬器；術(shù)后第21天，膠原組和明膠生物玻璃組可見完整的皮膚結(jié)構(gòu)，可見皮膚附屬器；羧甲基殼聚糖組雖然仍未見皮膚附屬器長出，但出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)；空白對照組大部分創(chuàng)面已被表皮覆蓋，出現(xiàn)完整的皮膚結(jié)構(gòu)，雖然無皮膚附屬器長出，但創(chuàng)面已基本愈合(圖4)。

A：空白對照組；B：膠原組；C：羧甲基殼聚糖組；D：明膠生物玻璃組a: Control group; B: Collagen group; C: Carboxymethyl chitosan group; D: Gelatin bioactive glass group圖4 各組創(chuàng)面術(shù)后第14、21天組織學觀察Fig. 4 Histological observation on skin wound healing 14, 21 days after treatment

3 討論

正常的創(chuàng)面愈合涉及一系列級聯(lián)事件，包括止血/炎癥期、增殖期和重塑期[1]。各種炎癥因子、細胞因子、激素等參與修復反應(yīng)[2-6]。在嚴重的病理條件下，如燒傷、燙傷、糖尿病創(chuàng)面，所有這些形態(tài)學事件都受損，阻礙正常的再上皮化和真皮修復過程，是皮膚組織創(chuàng)傷治療中最主要的挑戰(zhàn)。近年來，皮膚修復材料替代物在治療皮膚損傷方面提供了新的機會。多種皮膚敷料，包括絲素蛋白[7-8]、海藻酸鈉[9-10]、殼聚糖[10-12]、膠原蛋白[13-14]和明膠[14-15]等，正被用于促進愈合過程和保護皮膚免受進一步損害。構(gòu)建合適的皮膚損傷模型，為皮膚修復材料有效性的驗證奠定基礎(chǔ)，是當前面臨的重要任務(wù)。

糖尿病是胰島素分泌不足或胰島素作用障礙導致的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。糖尿病患者有10%～25%的幾率并發(fā)糖尿病足[16]，系由感覺神經(jīng)病變、足部畸形和動脈循環(huán)不足共同引起[17]，全球的發(fā)病率在4%～10%之間[18-19]。因此，構(gòu)建糖尿病大鼠的皮膚損傷模型，可有效模擬疾病的發(fā)生發(fā)展狀況，為探索相關(guān)的發(fā)病機制及皮膚修復材料有效性提供基礎(chǔ)。

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)是一種能破壞胰島β細胞的抗生素，已被證明具有致糖尿病的特性[20]，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于Ⅰ型糖尿病的實驗研究[21-24]。此外，大鼠因大小適宜、誘導期短、易于誘導病情和成本效益[25]，具有明顯的優(yōu)勢，SD大鼠和Wistar大鼠對STZ尤為敏感，并且雄激素能增強大鼠對STZ誘導的糖尿病的敏感性[26]，因此本研究選用雄性SD大鼠，通過腹腔單次注射STZ溶液以構(gòu)建糖尿病模型。實驗結(jié)果顯示，100 mg/Kg STZ濃度過高，大量胰島β細胞壞死和胰島素突然釋放導致了致死性低血糖癥，引起大鼠死亡。75 mg/Kg的STZ注射后大鼠血糖符合標準(高于16.7 mol/L)，且有更高的成模率(100%)，因此確定75 mg/kg的STZ單次腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型。

在糖尿病大鼠背部分別進行不同大小的全層皮膚切除，以尋找皮膚損傷模型的最佳創(chuàng)面大小。結(jié)果顯示，2 cm×2 cm組術(shù)后修復較1 cm×1 cm組平緩，利于皮膚修復材料有效性的比較。至此，標準化糖尿病大鼠皮膚損傷模型正式建立，即單次腹腔注射75 mg/kg STZ溶液，并在背部構(gòu)建2 cm×2 cm的全層皮膚缺損。

理想的創(chuàng)面敷料應(yīng)該使用方便，能夠促進創(chuàng)面愈合，無毒、非過敏、隔熱、不滲透細菌，允許適當?shù)臍怏w交換并具有成本效益[27]。本研究中所使用的膠原蛋白[13]、羧甲基殼聚糖[28]、生物玻璃[29]促進皮膚傷口愈合的作用均有報道。本研究以糖尿病大鼠皮膚損傷模型來評價三種材料對于修復難愈性創(chuàng)面的有效性。大體觀察顯示，3種材料組的愈合情況均優(yōu)于對照組；創(chuàng)面愈合率比較顯示，膠原組和生物玻璃組術(shù)后第3、7、14、21天的愈合率均高于空白對照組，促進皮膚愈合效果明顯，而羧甲基殼聚糖組因其明顯的止血效果，在恢復早期(第3天)效果較好，后期的創(chuàng)面愈合率均低于空白對照組，但無明顯差異，沒有促進皮膚愈合的效果。HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后第14天，膠原組和生物玻璃組已出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，皮膚附屬器清晰可見，皮膚愈合程度明顯優(yōu)于對照組，羧甲基殼聚糖組仍未形成層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，未見皮膚附屬器，愈合效果不佳；術(shù)后第21天，各組動物皮膚均已基本愈合。

綜上所述，本研究利用STZ和背部皮膚全層損傷成功建立糖尿病大鼠皮膚損傷模型，膠原蛋白和明膠生物活性玻璃均可對難愈性皮膚損傷進行有效修復，羧甲基殼聚糖僅表現(xiàn)為止血作用，未能有效促進傷口愈合。