自體骨髓單核細胞移植對兔退行性病變后椎間盤的修復作用

崔基浩 李創 馬文斌 李春 徐萬宏

腰椎間盤退行性病變是臨床常見疾病，嚴重影響患者的日常生活及工作[1]。椎間盤是由軟骨終板、纖維環及中間的髓核組成，正常的髓核細胞通過分泌各種生長因子維持細胞外基質的合成與分解代謝的動態平衡。在衰老、創傷、遺傳、生活方式等因素作用下，髓核細胞數量逐漸減少、功能減退，使其調節胞外基質的代謝平衡被打破，導致椎間盤退行性病變：蛋白多糖、Ⅱ型膠原合成逐漸減少，髓核組織滲透壓下降、水分丟失、椎間隙變窄、脊柱生物力學發生改變[2]。臨床表現為腰痛、椎間隙高度丟失及MRI T2W1加權像高信號消失等特征。已有的藥物及物理治療雖可延緩病程、改善部分癥狀，但無法逆轉疾病過程。手術治療包括椎間盤摘除、椎板切除椎管減壓、椎體間融合、人工椎間盤等[3]，均以破壞椎間盤的正常生理、解剖結構為代價，不能從根本上治愈椎間盤的退行性病變。骨髓單核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMNC)是由包括間充質干細胞、造血干細胞、造血祖細胞、內皮祖細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和血小板在內的異質性細胞群組成[4]，可產生大量的細胞因子和營養因子，能夠激活體內的內源性修復反應[5]。本研究將自體骨髓單核細胞注入兔退行性病變的椎間盤，利用影像學及組織學方法，觀察髓核含水量、椎間隙高度的維持及細胞形態、胞外基質含量，探討自體骨髓單核細胞對退行性病變后椎間盤的修復作用，以期為臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

新西蘭大白兔12只，3月齡，體質量約2.5～3.0 Kg，雌雄不限，隨機分為對照組(n=6)和治療組(n=6)。

1.2 研究方法

1.2.1 提取自體骨髓單核細胞

治療組實驗兔髂后上棘處穿刺，抽取骨髓(約1～2 mL)，與Hank's平衡鹽溶液1∶1混合，1 000 r/min離心30 min，按梯度界面回收單核細胞層，然后用生理鹽水配置成細胞密度為5×105cells/mL的細胞懸液，標記待用。

1.2.2 椎間盤穿刺造模

兩組實驗兔麻醉后，暴露L4/5、L5/6、L6/7椎間隙，使用16 G穿刺針沿椎間盤左側刺入，見膠凍樣髓核溢出即為造模成功。對照組直接縫合關閉傷口。治療組使用22 G針頭自椎間盤前方穿刺注入制備的BMMNCs懸液約0.3 mL，然后縫合關閉傷口。

1.3 觀察指標

1.3.1 椎間盤高度指數觀察

兩組分別在術后第1天和第4、8、24周時行腰椎側位X線攝片，使用影像軟件系統進行測量并計算椎間盤高度指數(Disc height index，DHI)。DHI=椎間盤高度/上位椎體高度×100%。

1.3.2 椎間盤MRI觀察

兩組分別在術后第4、8、24周進行MR T2W1加權像掃描，并以正常椎間盤MR T2W1加權像掃描為空白對照。

1.3.3 椎間盤組織學觀察

兩組分別在術后第4、8、24周完成影像學檢查后，取L4/5、L5/6、L6/7椎間盤組織行固定、包埋、切片及HE染色，并以正常椎間盤作為空白對照。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 椎間盤高度指數觀察對比

兩組在術后第1天和第4、8、24周分別進行腰椎側位X線攝片，并計算DHI。結果顯示，對照組的DHI均值分別為9.00%、7.15%、5.73%和4.18%，而治療組的DHI均值分別為9.10%、8.75%、8.70%、7.35%。治療組在阻止椎間隙高度丟失方面明顯優于對照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組各時間點椎間盤高度指數(DHI)Fig. 1 DHI in each group at different time points

2.2 椎間盤MR觀察對比

MR T2W1加權像掃描結果顯示，術后第4、8、24周時治療組椎間盤MR T2W1加權像信號始終高于對照組(P<0.05)，與正常椎間盤相近，說明治療組椎間盤含水量的維持明顯優于對照組。此外，還觀察到對照組的椎間隙變窄趨勢較治療組明顯(圖2)。

圖2 術后第8周各組椎間盤MR T2W1加權像Fig. 2 MR T2W1 weighted images of intervertebral discs in each group at the 8th week of postoperation

2.3 組織學觀察

組織學觀察顯示，正常髓核組織為有序的細胞外基質排列、分布均勻的橢圓形髓核細胞。治療組的髓核細胞數量與正常髓核相比相對減少，但排列規整，呈橢圓透明狀，胞外基質均勻。對照組的髓核細胞數量更加減少，分布零散、混亂，呈梭形及不規則形，體積變小甚至消失不見，胞外基質收縮、不均(圖3)。

圖3 各組各時間點椎間盤組織學觀察Fig. 3 Histological observation of intervertebral disc in each group at different time points

3 討論

椎間盤退行性病變臨床較為常見，保守治療僅可延緩疾病進程、緩解部分癥狀；手術治療均會破壞椎間盤的正常生理、解剖結構，且無法恢復正常的生理功能。目前研究表明，椎間盤內髓核細胞數量的減少及功能減退引起胞外基質蛋白含量下降是導致椎間盤退變的主要原因，這些病理改變會引起椎間盤組織含水量降低、滲透壓下降、營養通道關閉，進一步加劇疾病進程，最終引起脊柱的生物力學改變，產生腰痛、下肢放射麻痛、間歇性跛行、馬尾綜合征等一系列臨床癥狀[6]。因此，為了減緩甚至逆轉椎間盤的退變過程，恢復椎間盤的正常結構功能，可以通過移植具有類髓核細胞功能的外源細胞或者激活原有的髓核細胞功能，促使蛋白多糖及Ⅱ型膠原等胞外基質的合成，從而達到修復退變椎間盤的目的。近年來，在椎間盤退變的再生醫學研究中，間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)移植備受關注。MSCs是多能性細胞，具有很強的增殖、分化能力，且易從各種組織來源中獲得[7]。Deschepper等[8]證實，MSCs治療退變椎間盤具有一定的效果，表現為椎間盤高度增加、MRI T2W1加權信號增強、組織學分級改善、細胞外基質含量和相關基因表達的恢復等。然而，該方法目前尚存在一些問題，無法應用于臨床。因此，我們認為選擇一種具有與MSCs類似的再生作用，不需要體外擴增、易獲取及利于臨床轉化的細胞是解決上述問題的可能的途徑。

BMMNCs由包含MSCs、造血干細胞、造血祖細胞、內皮祖細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和血小板在內的異質性細胞群組成，對骨關節炎[9]、脊髓損傷[10]、缺血性腦損傷[11]等疾病具有治療作用；另外，BMMNCs的快速收集、移植等操作允許在手術室中完成，且無需體外培養[12]，從而降低了成本和污染風險。BMMNCs是一種比較理想的，有望用于修復椎間盤退變的外源性移植細胞。

當椎間盤發生退變時，其髓核細胞凋亡，細胞數量減少，胞外基質降解加快，蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少[13]；組織親水能力明顯下降，使椎間盤含水量顯著降低，椎間隙高度逐漸變窄。椎間盤退變時X線表現為椎間隙變窄、邊緣骨贅形成和脊柱曲線改變，其中椎間隙高度變窄為最具特征性的改變。本研究中，兩組術后的X線檢查結果顯示，治療組椎間盤的退變得到顯著減緩。

通過對椎間盤進行MR T2W1加權像掃描，評估其信號的強弱，反映出椎間盤的含水量變化及具有親水性帶電荷的蛋白多糖的含量，是評價椎間盤退變的一個重要指標。本研究結果顯示，治療組椎間盤MR T2W1加權像信號始終高于對照組，且較接近正常椎間盤的信號強度，說明本實驗中治療組椎間盤含水量的維持明顯優于對照組，證明治療組椎間盤的退變過程被延緩或中止，椎間盤得到一定修復。

椎間盤退變時其組織學層面的細胞形態、結構都會發生一定的病理變化，組織學染色觀察也是公認最準確的評價退變的方法[14]。本研究結果顯示，在髓核細胞形態、胞外基質分布及細胞數量方面，治療組明顯優于對照組，與正常椎間盤接近，也同樣說明了治療組椎間盤的退變得到有效減緩。

綜上所述，自體骨髓單核細胞對退變的椎間盤具有一定的修復再生作用，具有潛在的應用前景，值得進一步深入研究。