低分子肝素對(duì)肺腺癌A549 裸鼠VEGF 表達(dá)影響

陳小軍

（甘肅省人民醫(yī)院 甘肅 蘭州 730000）

肺癌是癌癥最常見的惡性腫瘤之一，其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都需要新生血管的支持，多種信號(hào)分子共同參與并調(diào)控腫瘤新生血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前已知活性最強(qiáng)的血管生成因子，可促進(jìn)腫瘤血管生成，與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究利用低分子肝素治療肺腺癌A549 裸鼠模型，旨在明確低分子肝素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

研究時(shí)間為2019 年3 月—9 月，肺腺癌A549 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基粉末購自美國Gibco 公司，抗VEGF 抗體購自美國Cell Signaling Techonlogy 公司。Balb/c 裸鼠（雄性，體質(zhì)量為18±2g）30只由本單位所在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可號(hào)：SYXK2019-0002。

1.2 肺腺癌A549 裸鼠模型的建立

肺腺癌A549 用含體積份數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，傳代3 次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)3×107/ml。取0.2ml 細(xì)胞懸液接種于Balb/c小鼠右腋下，以接種后2 ～9d 可在右腋下觸摸到腫瘤結(jié)節(jié)（腫瘤平均直徑≥5mm）為建模成功。

1.3 治療方法

將所有建模成功的裸鼠平分為兩組，模型組與肝素組，每組15 只。模型組：不給任何藥物治療。肝素組：飲水內(nèi)加入肝素500IU/ml，持續(xù)應(yīng)用觀察4 周，2 次/周。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）在治療后4 周處死裸鼠，完整地剝離瘤組織，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（模型平均瘤質(zhì)量-處理組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。（2）取處死大鼠的組織，采用免疫組化法分別檢測(cè)VEGF 表達(dá)水平。制成標(biāo)本，于4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過夜，加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液30min，0.01MPBS 清洗5min×3。加入配好的0.3%Triton×100 30min，0.01MKPBS 清洗5min×3。加入用血清稀釋液稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MKPBS 洗5min×3。加入0.01MKPBS 稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS 洗5min×3。進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間不超過30min，用蒸餾水迅速?zèng)_3 次后加入0.01MKPBS 終止反應(yīng)，梯度酒精脫水、鏡下拍照，記錄VEGF 相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 抑瘤率對(duì)比

所有裸鼠均建模成功，表現(xiàn)為精神差、毛發(fā)脫落、活動(dòng)度減少、皮毛缺少光澤，飼料消耗量減少。治療4 周后肝素組的抑瘤率均顯著高于模型組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組抑瘤率對(duì)比（±s，%）

表1 兩組抑瘤率對(duì)比（±s，%）

組別 只數(shù)（n） 抑瘤率肝素組 15 45.11±4.39模型組 15 0.00±0.00 P-＜0.05

2.2 VEGF 陽性表達(dá)率對(duì)比

治療4 周后肝素組的瘤組織VEGF 陽性表達(dá)率顯著低于模型組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組瘤組織VEGF 陽性表達(dá)率對(duì)比（±s，%）

表2 兩組瘤組織VEGF 陽性表達(dá)率對(duì)比（±s，%）

組別 只數(shù)（n） VEGF 陽性表達(dá)率肝素組 15 0.55±0.04模型組 15 2.87±0.09 P-＜0.05

3.討論

由于各種因素影響，我國肺癌發(fā)病人數(shù)逐年增加，其病死率在全部惡性腫瘤中上升幅度最大。影響肺癌患者的預(yù)后因素比較多，其中一個(gè)重要因素為腫瘤轉(zhuǎn)移。是由多種因素參與的復(fù)雜過程，涉及到腫瘤新生血管的形成與細(xì)胞外基質(zhì)的降解等。低分子肝素已被廣泛用于各種情況下的抗凝治療，也具有其他廣泛的生物學(xué)活性，能增強(qiáng)化療藥物效果[1]。低分子肝素可抑制腫瘤細(xì)胞在臟器毛細(xì)血管的滯留，阻斷P-選擇素和L-選擇素與腫瘤細(xì)胞表面的粘蛋白配體的結(jié)合，影響內(nèi)皮細(xì)胞釋放的組織因子途徑抑制劑和腫瘤細(xì)胞宿主相互作用，減少轉(zhuǎn)移，且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。血管生成的主要機(jī)制是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的過度表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，新血管的形成是腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)的重要條件。作為腫瘤基質(zhì)和毛細(xì)血管網(wǎng)形成的基礎(chǔ)，VEGF 是特異性最高的血管生成調(diào)控因子，在肺癌組織中有較高的表達(dá)。本研究顯示治療4 周后肝素組的瘤組織VEGF 陽性表達(dá)率顯著低于模型組（P＜0.05），表明低分子肝素能影響腫瘤新生血管的形成。低分子肝素能夠通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞與VEGF 的結(jié)合，增強(qiáng)抗凝血酶的作用，減少肝素酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分解，從而對(duì)腫瘤新生血管的形成產(chǎn)生抑制作用[3]。

綜上，低分子肝素在肺腺癌A549 裸鼠中的應(yīng)用能抑制VEGF的表達(dá)，具有很好的抑瘤效果。