關節軟骨中整合素αvβ3表達與老年膝骨關節炎退變程度的相關性

周超 王刊石 趙磊

(江南大學附屬醫院(無錫三院)骨科，江蘇 無錫 214041)

膝關節骨關節炎作為一種嚴重損傷膝關節功能的退行性疾病，多伴隨有軟骨下骨質增生，易發于中老年群體，通常表現為膝關節處疼痛難忍、上下樓梯吃力，嚴重者膝關節處會出現腫脹而無法行動，極大地影響患者生活質量〔1,2〕。整合素(ITG)屬于細胞黏附分子家族的一種異二聚體跨膜蛋白，主要由α和β兩個亞單位組成，其αv亞基與不同的β亞基結合后可作為玻連蛋白及纖連蛋白的受體，在細胞-細胞、細胞-基礎信號轉導過程中發揮雙向作用，進而調控細胞分化、轉移、黏附等進程〔3,4〕。既往研究發現，ITGα5β1在早期發育性髖關節發育不良動物模型中表達水平與髖臼軟骨的退變程度顯著相關〔5〕，ITGαvβ3作為與ITGα5β1功能相似的家族成員，其在骨性關節炎不同退變程度關節軟骨中表達差異性的相關研究較少，因此本研究利用全膝關節置換術得到的不同退變程度關節軟骨標本作為研究對象，來分析關節軟骨中ITGαvβ3表達水平與老年膝骨關節炎退變程度的相關性。

1 材料與方法

1.1標本樣本來源 回顧性分析江南大學附屬醫院(無錫三院)2016年1月至2018年12月收治的20例老年膝骨關節炎行全膝關節置換術患者，均符合中華醫學會骨科分會2007年修訂的膝骨關節炎診斷標準〔6〕。關節軟骨標本來源于全膝關節置換中股骨內外踝負重面軟骨，根據Outerbridge分級標準〔7〕利用鋒利的手術刀選擇不同退變程度的軟骨標本71例，均分為3塊，1塊用中性甲醛固定進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察，其余2份用液氮迅速冷凍后保存于-80℃超低溫冰箱待測。

1.2主要試劑 ITGαv、ITGβ3、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(購自賽默飛世爾科技公司)；兔抗人ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13、GAPDH抗體(購于Cell signaling technology)。

1.3標本分組 根據HE染色結果，參考Mankin評分標準將所有標本分為正常組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組。正常組0分(5例)；輕度退變組1～6分(23例)；中度退變組7～9分(24例)；重度退變組10～14分(19例)。

1.4qRT-PCR檢測 取軟骨組織標本50 μg，按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，OD值(A260/A280)=1.8～2.0，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。反轉錄體系(10 μl)：2×miRNA反應混合液5 μl，0.1 % BSA 1 μl，miRNA PrimeScript? RT酶混合物1 μl，總RNA 0.5 μl，去RNA酶雙蒸水(ddH2O)2.5 μl。反應條件設置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR體系10 μl：SYBR?Prmix Ex Tap Ⅱ(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX熒光參比染料(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。具體操作見試劑盒說明書。PCR參數設置：50℃激活聚合酶5 min，95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。每個樣孔設置3個復孔。引物信息見表1。用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.5Western印跡檢測 取關節軟骨標本200 μg，用蛋白裂解液提取總蛋白質，調整各組蛋白濃度一致后，經十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、電轉膜至甲醛處理過預處理過的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗人ITGαvβ3(1∶500)、MMP-9(1∶500)、MMP-13(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，電化學發光(ECL)液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標蛋白與內參積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1不同退變程度關節軟骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相對表達水平 ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13的表達水平在膝關節炎關節軟骨中存在差異性表達，并且隨著關節軟骨退變程度增加其表達水平明顯升高，組間相比有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2不同退變程度關節軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平在膝關節炎關節軟骨中存在差異性表達，并且隨著關節軟骨退變程度增加其表達水平明顯升高，組間相比有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖1。

2.3ITGαvβ3蛋白表達與MMP-9、MMP-13蛋白表達水平相關性分析 ITGαvβ3蛋白表達水平與MMP-9、MMP-13蛋白表達水平呈顯著正相關(P<0.001)；MMP-9蛋白表達水平與MMP-13蛋白表達水平呈顯著正相關(P<0.001)。見圖2。

表2 不同退變程度關節軟骨中ITGαv、ITGβ3、MMP-9、MMP-13 mRNA相對表達情況

與正常組相比：1)P<0.05；與輕度退變組相比：2)P<0.05；與中度退變組相比：3)P<0.05；下表同

2.4ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平與關節軟骨退變程度相關性分析 ITGαvβ3、MMP-9及MMP-13蛋白表達水平均與關節軟骨退變程度呈顯著正相關(P<0.001)。見圖3。

表3 不同退變程度關節軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平

1：正常組；2：輕度退變組；3：中度退變組；4：重度退變組圖1 不同退變程度關節軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達

圖2 ITGαvβ3蛋白表達與MMP-9、MMP-13蛋白表達水平相關性

橫坐標1.正常，2.輕度退變，3.中度退變，4.重度退變圖3 ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平與關節軟骨退變程度相關性

3 討 論

骨關節炎作為人類較為常見的一種退行性疾病，在發病過程中可觀察到相關組織結構上的顯著變化，這些變化與力學、生物學、遺傳基因、免疫、代謝等因素關系密切〔8〕。目前研究認為骨關節炎的發生發展是軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨降解合成耦聯失衡引起的〔9〕。ITG作為關節軟骨表面的機械敏感受體，主要發揮著介導胞外信號向胞內信號轉換的作用，當受到各種應力刺激后，能夠通過抑制細胞外基質的降解、增加細胞外基質的合成、抑制軟骨細胞凋亡等方式來介導關節軟骨的修復作用〔10,11〕。有研究表明，在骨性關節炎軟骨細胞中ITG的β1亞基及所有類型的α亞基均會被表達來參與多種形式的外界應力刺激〔12〕。本研究選用了膝骨關節炎行置換術后的關節軟骨標本，并根據Outerbridge分級和HE染色結果分為了不同退變程度組別，對ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13的mRNA相對表達水平進行分析發現，和正常關節軟骨相比，不同退變程度關節軟骨中的ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表達存在明顯差異，并且退變程度越嚴重表達水平越高，ITGαvβ3在正常軟骨細胞中受到應力刺激時與白細胞介素(IL)-4表面受體形成異源二聚體，并通過Junus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉導和轉錄活化蛋白(STAT)信號轉導通路來發揮保護軟骨的作用〔13〕，但是骨關節炎病理狀態是則會在細胞外基質中降解的纖維蛋白碎片刺激下，激活蛋白激酶(PKC)和細胞外信號調節激酶(ERK)，來促進細胞外基質降解關鍵蛋白MMP-9、MMP-13合成增加，加重軟骨細胞損傷，加速軟骨退化〔14〕。對不同退變程度關節軟骨中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平的分析發現，與mRNA相對表達水平一致，軟骨退變程度越嚴重中ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平越高。

ITGαvβ3作為骨橋蛋白(OPN)的主要受體，由于OPN分子內特異性及高度保守的RGD序列存在，能夠和ITGαvβ3結合后，激活FAK/Src復合物及下游Ras-MAPK信號轉導途徑，改變細胞骨架還能夠促進腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、IL-6等炎性細胞因子水平表達，加重炎性反應，對軟骨組織造成持續性傷害〔15〕。MMPs在調控細胞外基質代謝中發揮著重要的作用，是機體生理重建和病理破壞的主要基礎因素之一，在骨性關節炎病理狀態下，MMPs大量合成與MMP抑制劑(TIMP)間的平衡被打破，關節軟骨的主要成分Ⅱ型膠原在MMP-13的作用下大量降解，膠原網被破壞，軟骨細胞將暴露在炎性因子的攻擊下，引起凋亡，最終引起軟骨退行性損傷〔16,17〕。本次研究對ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平之間的相關性分析發現ITGαvβ3、MMP-9、MMP-13表達水平對于關節軟骨的退變程度均有一定的診斷價值。

綜上所述，ITG作為軟骨細胞中重要的信號轉導分子，在骨性關節炎中的相關研究是目前的熱點方向之一，本研究的ITGαvβ3作為IGT眾多亞型之一，與關節軟骨的退變程度之間呈顯著正相關，并且還與MMP-9和MMP-13之間也呈顯著正相關，但ITGαvβ3參與骨性關節炎發生進展的具體作用機制仍不清楚，還需要進一步深入研究。